Summary

زرع القنية المباشرة في ماجنا سيسترنا من الخنازير

Published: June 09, 2021
doi:

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لزرع القنية المباشرة في ماجنا cisterna من الخنازير.

Abstract

النظام الجليميفي هو نظام لإزالة النفايات في الدماغ يعتمد على تدفق السائل النخاعي (CSF) في المساحات المحيطة بفترة ما حول الأوعية الدموية المرتبطة بالخلايا الفلكية وقد تورط في إزالة الببتيدات العصبية السمية مثل أميلويد بيتا. يؤدي ضعف وظيفة الجلمفاتيك إلى تفاقم أمراض الأمراض في النماذج الحيوانية للأمراض العصبية التنكسية ، مثل مرض الزهايمر ، مما يسلط الضوء على أهمية فهم نظام التخليص هذا. غالبا ما تتم دراسة النظام الجليمافي بواسطة عبوات cisterna magna (CMc) ، حيث يتم تسليم التتبع مباشرة إلى السائل النخاعي (CSF). ومع ذلك، فقد أجريت معظم الدراسات على القوارض. هنا، ونحن نظهر التكيف من تقنية CMc في الخنازير. باستخدام CMc في الخنازير ، يمكن دراسة النظام الجليمفي بدقة بصرية عالية في الأدمغة الجيرنسيفالية ، وبذلك يسد الفجوة المعرفية بين القوارض والجاذبية البشرية.

Introduction

السائل النخاعي (CSF) هو نسبة فائقة من الدم موجود داخل وحول الجهاز العصبي المركزي (CNS)1,2. وبصرف النظر عن إعطاء الطفو للدماغ أو امتصاص القوى الميكانيكية الضارة، CSF يلعب أيضا دورا محوريا في إزالة النفايات الأيضية من CNS3. يتم تسهيل إزالة النفايات من خلال نظام الجليمافتا الذي تم توصيفه مؤخرا والذي يسمح بالتدفق الحراري ل CSF عبر بارنشيما الدماغ عبر المساحات المحيطة بوعية الدموية (PVS) ، والتي تطوق الشرايين المخترقة3،4،5. وقد تبين أن هذه العملية تعتمد على aquaporin-4 (AQP4)، وهي قناة مائية يتم التعبير عنها في المقام الأول على النهاية الفلكية، المرتبطة ب PVS4,6. وتتحقق دراسة النظام الجليمفاتيكي من خلال التصوير الحي والجسم الحي السابق، باستخدام المجهر الضوئي المتقدم أو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، بعد إدخال متتبع فلوري/مشع أو عامل تباين في CSF7,8,9,10,11.

وهناك طريقة فعالة لإدخال التتبع في CSF دون تكبد أضرار في الدماغ parenchyma هو من خلال cisterna ماجنا cannulation (CMc)12,13. وقد أجريت أغلبية كبيرة من جميع الدراسات الجليمفية، حتى الآن في القوارض وتجنبها في الثدييات العليا بسبب الغازية من CMc إلى جانب البساطة العملية للعمل مع الثدييات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الجماجم الرقيقة للفئران بالتصوير الحي دون الحاجة إلى نافذة الجمجمة وتسمح لاحقا باستخراج الدماغ غير المعقد1114. وقد أسفرت التجارب التي أجريت على البشر عن تنظير كبير قيم في بيانات الجسم الحي على وظيفة الجليمافيتيك، ولكنها اعتمدت على حقن التتبع داخل اللثة في العمود الفقري القطني البعيدة، وعلاوة على ذلك، الاستفادة من التصوير بالرنين المغناطيسي الذي لا يسفر عن دقة كافية لالتقاط استئصال الدقيقة النظام الجليمافي7،15،16 . فهم الهندسة المعمارية ومدى النظام الجلمفي في الثدييات العليا أمر ضروري لترجمته إلى البشر. من أجل تسهيل الترجمة الجليمفاتيكية للبشر ، من المهم تطبيق التقنيات التي يتم تنفيذها في القوارض على الثدييات العليا من أجل السماح بإجراء مقارنات مباشرة للنظام الجليمفي عبر أنواع من الإدراك المتزايد وتعقيد الدماغ17. الخنازير والأدمغة البشرية هي جيرونسيفال، وامتلاك neuroarchitecture مطوية، في حين أن أدمغة القوارض هي lissencephalic، وبالتالي وجود فرق كبير بين بعضها البعض. من حيث الحجم الإجمالي ، فإن أدمغة الخنازير هي أيضا أكثر قابلية للمقارنة مع البشر ، كونها أصغر 10-15 مرة من الدماغ البشري ، في حين أن أدمغة الفئران أصغر 3000 مرة18. من خلال فهم أفضل للنظام الجليمفاتيكي في الثدييات الكبيرة ، قد يكون من الممكن استخدام نظام الجليمفاتيك البشري للتدخل العلاجي في المستقبل في ظروف مثل السكتة الدماغية وإصابات الدماغ الرضية والتنكس العصبي. CMc المباشر في الخنازير في الجسم الحي هو الأسلوب الذي يسمح للفحص المجهري الخفيف عالي الدقة للنظام الجلمفي في الثدييات العليا. وعلاوة على ذلك، ونظرا لحجم الخنازير المستخدمة، فمن الممكن تطبيق أنظمة رصد مماثلة لتلك المستخدمة في العمليات الجراحية البشرية مما يجعل من الممكن لتوثيق وتنظيم الوظائف الحيوية بإحكام من أجل تقييم كيفية مساهمة هذه في وظيفة الجليمفاتيك.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للتوجيه الأوروبي 2010/63/EU ووافقت عليها لجنة مالمو لوند الأخلاقية لأبحاث الحيوان (Dnr 5.8.18-05527/2019) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية ل CODEX لمجلس البحوث السويدي. 1. إعداد الراسم إعداد CSF الاصطناعي (126 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM NaH2PO4، 2 mM MgCl2، 2 …

Representative Results

بمجرد أن يفقد الخنزير وعيه ، يتم ملامسته ، ويتم وضع علامة على تشريح سطحه ، بدءا من قمة القذالي (OC) والعمل نحو الفقرات الصدرية (التلفزيون) وكل قاعدة أذن (EB). وعلى هذا المنوال يتم إجراء الشقوق الجلدية (الشكل 1A). يتم إعادة استئصال طبقات العضلات الثلاث بما في ذلك trapezius ، semispinalis capitus …

Discussion

هنا، يوصف، بروتوكول مفصل لتنفيذ العلبة المباشرة للشهامة cisterna في الخنازير، بما في ذلك الإعداد اللازم، وإجراء العمليات الجراحية، ضخ التتبع واستخراج الدماغ. وهذا يتطلب شخص لديه خبرة وشهادة للعمل مع الحيوانات الكبيرة. إذا نفذت بشكل صحيح، وهذا يسمح لتسليم الجزيئات المطلوبة مع ضمان مباشرة في …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة كنوت وأليس والنبرغ، وهجارفوندن، ومؤسسات وينر غرين، ومؤسسة كرافورد.

Materials

0.01% azide in PBS Sigmaaldrich S2002
18G needle Mediq
1ml Syringe FischerSci 15849152
20G cannula Mediq NA
22G cannula Mediq NA
4% paraformaldehyde Sigmaaldrich P6148
Anatomical forceps NA NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate ThermoFischer A34785 2 vials (10mg)
CaCl2 Sigmaaldrich C1016
Chisel ClasOhlson 40-8870
Dental cement Agnthos 7508
compact saw ClasOhlson 40-9517
Glucose Sigmaaldrich G8270
Hammer ClasOhlson 40-7694
Insta-Set CA Accelerator BSI-Inc BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension Bbraun NA
KCl Sigmaaldrich P9333
Marker pen NA NA
MgCl2 Sigmaaldrich M8266
MilliQ water NA NA
NaCL Sigmaaldrich S7653
NaH2PO4 Sigmaaldrich S8282
NaHCO3 Sigmaaldrich S5761
No. 20 scalpel blade Agnthos BB520
No. 21 Scalpel blade Agnthos BB521
No. 4 Scalpel handle Agnthos 10004-13
Saline Mediq NA
Salmon knife Fiskers NA
Self-retaining retractors NA NA
Superglue NA NA
Surgical curved scissors NA NA
Surgical forceps NA NA
Surgical towel clamps NA NA

References

  1. Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
  2. Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
  3. Nedergaard, M. Garbage truck of the brain. Science. 340 (6140), 1529-1530 (2013).
  4. Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
  5. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
  6. Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
  7. Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
  8. Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
  9. Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
  10. Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
  11. Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
  12. Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
  13. Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, (2019).
  14. Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
  15. Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
  16. Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
  17. Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
  18. Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic function in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2021).
  19. Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
  20. D’Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
  21. Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
  22. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
  23. Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
  24. Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).

Play Video

Cite This Article
Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Direct Cannula Implantation in the Cisterna Magna of Pigs. J. Vis. Exp. (172), e62641, doi:10.3791/62641 (2021).

View Video