Сфинголипиды являются биологически активными метаболитами с хорошо известной ролью в заболеваниях человека. Характеристика изменений в тканях с помощью масс-спектрометрии может выявить роли в этиологии заболевания или определить терапевтические мишени. Однако OCT-соединение, используемое для криоконсервации в биорепозиториях, мешает масс-спектрометрии. Описаны методы анализа сфинголипидов в тканях человека, встроенных в ОКТ с помощью LC-ESI-MS/MS.
Сфинголипиды являются клеточными компонентами, которые имеют хорошо установленную роль в метаболизме и болезнях человека. Масс-спектрометрия может быть использована для определения того, изменяются ли сфинголипиды при заболевании, и для изучения того, могут ли сфинголипиды быть клинически нацелены. Тем не менее, надлежащим образом подготовленные проспективные исследования, которые приобретают ткани непосредственно из хирургического набора, могут быть трудоемкими и технически, логистически и административно сложными. Напротив, ретроспективные исследования могут использовать криоконсервированные человеческие образцы, уже доступные, обычно в больших количествах, в тканевых биорепозиториях. Другие преимущества получения тканей из биорепозиториев включают доступ к информации, связанной с образцами тканей, включая гистологию, патологию и в некоторых случаях клинико-патологические переменные, все из которых могут быть использованы для изучения корреляций с данными липидомики. Однако технические ограничения, связанные с несовместимостью оптимальной температуры резания соединения (ОКТ), используемого в криоконсервации и масс-спектрометрии, являются техническим барьером для анализа липидов. Тем не менее, ранее мы показали, что OCT может быть легко удален из образцов биорепозиториев человека посредством циклов промывки и центрифугирования без изменения их содержания сфинголипидов. Мы также ранее установили, что сфинголипиды в тканях человека, криоконсервированные в ОКТ, стабильны до 16 лет. В этом отчете мы описываем этапы и рабочий процесс анализа сфинголипидов в образцах тканей человека, которые встроены в OCT, включая промывку тканей, взвешивание тканей для нормализации данных, извлечение липидов, подготовку образцов для анализа с помощью жидкостной хроматографии электрораспылительной ионизационной тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS / MS), интеграцию данных масс-спектрометрии, нормализацию данных и анализ данных.
Сфинголипиды являются биологически активными метаболитами, известными своей ролью в метаболизме человека и заболеваниях 1,2. Они регулируют сложные клеточные процессы, такие как миграция клеток, выживание и гибель клеток, движение клеток, везикулярный трафик, клеточная инвазия и метастазирование, ангиогенез и производство цитокинов 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Дефекты в регуляции метаболизма сфинголипидов способствуют инициации и прогрессированию рака, определяют, насколько агрессивны раковые заболевания, и как рак реагирует и развивает устойчивость к терапии 3,10. Поэтому из-за этих широких воздействий на этиологию заболевания аналитические методы, которые могут точно установить специфические для заболевания изменения сфинголипидов, являются важными инструментами. Масс-спектрометрия (МС) является наиболее точным и надежным методом анализа изменений сфинголипидов.
Человеческие образцы, которые могут быть использованы для анализа сфинголипидных изменений, могут быть получены перспективно из хирургического набора или ретроспективно из тканевых биорепозиториев. Свежие ткани от операции выгодны, потому что они могут быть непосредственно проанализированы РС или другими аналитическими методами. Тем не менее, приобретение тканей в перспективе имеет административные, технические и логистические препятствия, и сбор достаточного количества образцов для достижения статистической мощности может быть сложной задачей. Получение тканей из биорепозиториев выгодно, потому что они могут быть приобретены ретроспективно, в большом количестве, а биорепозитории подтверждают гистологию и патологию, используют стандартные операционные процедуры для криогенного сохранения и хранения тканей и могут предоставлять клинико-патологические данные, которые могут быть использованы для корреляционного анализа. Однако для сохранения молекулярных и структурных особенностей биорепозитории могут криоконсервировать ткани, встраивая их в соединение оптимальной температуры резания (ОКТ), которое, как мы показали, мешает анализам нормализации данных и количественному определению сфинголипидов с помощью жидкостной хроматографии электрораспылительной ионизационной тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS)11 . Также было показано, что поливиниловый спирт и полиэтиленгликоль, первичные компоненты в соединении OCT, приводят к подавлению ионов в других платформах анализаMS 12,13,14,15. Поэтому соединение OCT должно быть удалено из тканей перед сфинголипидомическим анализом РС.
В предыдущем отчете мы подтвердили протокол удаления соединения OCT из образцов человека для анализа LC-ESI-MS/MS11 и методологию, используемую для взвешивания тканей для нормализации данных11. Здесь мы подробно описываем этапы протокола удаления соединений sphingolipidomic OCT (sOCTrP) и показываем репрезентативные данные опухолей аденокарциномы легких человека и нормальных прилегающих невовлеченных тканей.
ОКТ является распространенным долгосрочным криосохраняющим агентом, используемым в биорепозиториях. Однако ОКТ может привести к подавлению ионов, когда ткани анализируются различными масс-спектрометрическими платформами 12,13,14,15, ил?…
The authors have nothing to disclose.
Услуги и поддержка исследовательского проекта были предоставлены VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core и VCU Lipidomics and Metabolomics Core, которые частично поддерживаются финансированием nih-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Эта работа была поддержана Национальными институтами грантов здравоохранения R21CA232234 (Сантьяго Лима).
1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |