Расщепление под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) является эффективной стратегией эпигеномного профилирования хроматина. Этот протокол представляет собой усовершенствованную стратегию CUT&Tag для профилирования модификаций гистонов в растениях.
Эпигеномная регуляция на хроматическом уровне, включая модификации ДНК и гистонов, поведение факторов транскрипции и некодирующие РНК с их рекрутированными белками, приводят к временному и пространственному контролю экспрессии генов. Расщепление под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) представляет собой метод ферментного связывания, при котором специфический белок хроматина сначала распознается по его специфическому антителу, а затем антитело связывает белок слияния белка А-транспозазы (pA-Tn5), который расщепляет целевой хроматин in situ путем активации ионов магния. Здесь мы предоставляем наш ранее опубликованный протокол CUT&Tag с использованием интактных ядер, выделенных из аллортетраплоидных листьев хлопка с модификацией. Этот пошаговый протокол может быть использован для эпигеномных исследований растений. Кроме того, существенные модификации для выделения ядер растений снабжены критическими комментариями.
Участки ДНК, связывающие транскрипционный фактор, и открытый хроматин, связанный со знаками модификации гистона, играют решающую функциональную роль в регулировании экспрессии генов и являются основными направлениями эпигенетических исследований1. Традиционно анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) в сочетании с глубоким секвенированием (ChIP-seq) были использованы для общегеномной идентификации специфических модификаций гистонов хроматина или мишеней ДНК с конкретными белками и широко распространены в области эпигенетики2. Технология расщепления под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) была первоначально разработана лабораторией Хеникова для захвата связанных с белком фрагментов ДНК по всему геному5. По сравнению с ChIP, CUT&Tagcan генерирует библиотеки ДНК с высоким разрешением и исключительно низким фоном, используя небольшое количество клеток с упрощенной процедурой3. На сегодняшний день в клетках животных установлены методы анализа хроматиновых областей со специфическими модификациями гистонов с использованием CUT&Tag4,5. В частности, одноклеточный CUT&Tag (scCUT&Tag) также был успешно разработан для тканей и клеток человека6. Однако из-за сложности клеточной стенки и вторичных метаболитов CUT&Tag по-прежнему технически сложен для растительных тканей.
Ранее мы сообщали о протоколе CUT&Tag с использованием интактных ядер, выделенных из аллотетраплоидных листьев хлопка4. Чтобы продемонстрировать эффективность выделения ядер и захвата ДНК с помощью растительной ткани, процедура профилирования представлена здесь. Основные этапы включают выделение интактных ядер, инкубацию in situ с антителом для модификации хроматина, инкубацию транспозазы, интеграцию адаптеров и подготовку библиотеки ДНК. Поиск и устранение неисправностей сосредоточен на подготовке библиотеки CUT&Tag к выделению ядер растений и контроле качества.
В этом исследовании мы представляем усовершенствованную стратегию CUT&Tag для растений. Мы не только предоставляем пошаговый протокол профилирования H3K4me3 в листьях хлопка, но также предоставляем оптимизированную методологию выделения ядер растений, включая стратегию выбора концентрации моющего средства для правильного лизиса клеток и стратегию фильтрации ядер. Подробные шаги с критическими комментариями также включены в этот обновленный протокол.
Здесь мы описали CUT&Tag, технологию для генерации библиотек ДНК с высоким разрешением и исключительно низким фоном с использованием небольшого количества клеток с упрощенной процедурой по сравнению с иммунопреципитацией хроматина (ChIP). Наш успех с профилированием H3K4me3 в листьях хлопка п…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) и Фондов фундаментальных исследований для центральных университетов, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Хайнаньского провинциального фонда естественных наук Китая (320LH002) и проекта JCIC-MCP.
Antibody | |||
Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
Chemicals | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
chloroform | |||
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
ethanol | |||
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
Enzyme | |||
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |