Burada, kolesterol fazlasının karaciğer mikroçevresi ve bağışıklık hücresi manzarası üzerindeki etkisini incelemek için alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ile ilişkili Hepatosellüler Karsinom (HCC) zebra balığı modelinin nasıl üretileceğini sunuyoruz.
Karaciğer kanseri şu anda dünya çapında kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir ve Hepatosellüler Karsinom (HCC) tüm karaciğer kanseri vakalarının% 75-90’ını oluşturmaktadır. Hepatit B / C’yi önlemek ve tedavi etmek için etkili tedavilerin sunulmasıyla, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ve alkolsüz steatohepatit (NASH) olarak bilinen daha agresif form, modern toplumlarda HCC’yi geliştirmek için hızla bir numaralı risk faktörü haline gelmektedir. NASH’ın HCC’nin gelişimindeki rolünü daha iyi anlamak için NASH ile ilişkili bir HCC zebra balığı tasarladık. Zebra balığı larvalarının optik berraklığı ve genetik izlenebilirliği, onları invaziv olmayan floresan canlı görüntüleme kullanarak karaciğer mikroçevresini ve bağışıklık hücresi kompozisyonunu incelemek için çekici ve güçlü bir model haline getirir. Bu protokol, kolesterol fazlasının karaciğer mikro ortamındaki etkisini ve hastalığın erken evrelerinde bağışıklık hücresi kompozisyonu üzerindeki etkisini araştırmak için NASH ile ilişkili HCC zebra balığı modelinin nasıl kullanılacağını açıklar. İlk olarak, hepatosit spesifik aktif beta-katenini eksprese eden HCC larvalarını (s704Tg), NASH ile ilişkili bir HCC modeli geliştirmek için 8 gün boyunca% 10 yüksek kolesterol diyeti ile besliyoruz. Burada, karaciğer alanı, hücre ve nükleer morfoloji (hepatositler alanı, nükleer alan, nükleer:sitoplazmik oran (N:C oranı), nükleer dairesellik, mikronüklei/nükleer herniasyon skorlaması) ve anjiyogenez gibi non-invaziv konfokal mikroskopi ile karaciğerdeki birçok erken malignite özelliğinin değerlendirilmesinde farklı transgenik çizgilerin nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Daha sonra, etiketli bağışıklık hücreleri (nötrofiller, makrofajlar ve T hücreleri) ile transgenik çizgiler kullanarak, NASH ile ilişkili HCC larvalarında karaciğer bağışıklık hücresi kompozisyonunun nasıl analiz edileceğini gösteriyoruz. Tarif edilen teknikler, erken hepatokarsinogenez aşamalarında karaciğer mikroçevresini ve bağışıklık hücresi kompozisyonunu değerlendirmek için yararlıdır, ancak diğer karaciğer hastalığı modellerinde bu özellikleri incelemek için de değiştirilebilirler.
Hepatosellüler Karsinom (HCC), sınırlı tedavi seçenekleri olan agresif bir kanserdir. HCC’li tüm hastaların% 30’undan fazlasının obez olduğu ve NAFLD 1,2,3,4’ün agresif bir formu olan NASH’ye sahip olduğu bulunmuştur. Kalori bakımından zengin diyetlerin tüketimi, lokal ve sistemik metabolik kaymalara neden olan ve steatoz, hepatosit hasarı, inflamasyon ve fibrozu tetikleyen yağ asidi mevcudiyetini büyük ölçüde arttırır – NASH’nin tüm temel özellikleri. NASH’nin HCC’ye ilerlemesi, karaciğerde lipitlerin birikmesini içerir, bu da inflamasyonu tetikler ve bağışıklık hücresi kompozisyonunu değiştirir 5,6,7. Karaciğer hastalığı progresyonu sırasında karaciğer mikroçevresinin ve bağışıklık hücresi manzarasının nasıl değiştiğini ve bazı etiyolojik faktörlere bağlı olarak nasıl değiştiğini anlamak özellikle ilgi ve önem taşımaktadır. Kolesterol fazlasının karaciğer mikro ortamı ve bağışıklık hücresi manzarası üzerindeki etkisini daha iyi tanımlamak için, NASH ile ilişkili HCC’nin benzersiz bir zebra balığı modelini geliştirdik. Bu modelin kullanımı bize diyet ve aşırı beslenmenin karaciğer mikroçevresi ve karaciğer hastalığı progresyonu üzerindeki etkisini daha iyi anlamamızı sağlamıştır.
Fareler ve insan doku örnekleri gibi memeli modelleri, steatohepatit ve steatoz8’in patogenezini anlamada gerekli olmuştur. Fareler karaciğer hastalığı ve kanser için tercih edilen modeldir, ancak hücresel düzeyde optik netlikten yoksundurlar, insan doku örnekleri ise genellikle hayvan modellerinin taklit edebileceği 3D ortamdan yoksundur. Bu engeller Zebra Balığını araştırma topluluğunda güçlü bir model haline getirmiştir. Zebra balığı, en az% 70 gen koruması ile insanlarla dikkate değer benzerliklere sahiptir. Karaciğer mikroçevresini, hepatik hücresel bileşimini, fonksiyonunu, sinyalizasyonunu ve yaralanmalara yanıtı korurlar 9,10. HCC’nin transgenik zebra balığı modeli ile birlikte yüksek kolesterollü bir diyet (HCD) kullanarak, NASH ile ilişkili HCC’nin bir zebra balığı modelini geliştirdik.
Burada, NASH ile ilişkili HCC zebra balığı modelinin nasıl oluşturulacağını ve karaciğer mikroçevresinin nasıl çalışılacağını ve in vivo olarak erken malignite özelliklerinin nasıl ele alınacağını açıklayan bir protokol sunuyoruz. İnvaziv olmayan konfokal mikroskopiyi, floresan etiketli hepatosit membran ve çekirdeğe sahip zebra balığı transgenik çizgileri ile birlikte kullanarak, karaciğer morfolojisini (alan, hacim ve yüzey alanı), hücre ve nükleer morfolojiyi (hepatositler alanı, nükleer alan, N: C oranı, nükleer dairesellik, mikronüklei / nükleer herniasyon skorlaması) ve anjiyogenezi (damar yoğunluğu) analiz ederek erken malignite özelliklerini ele alabiliriz. İmmün hücre mikroçevresi, hepatokarsinogenez11,12,13,14 üzerinde de önemli bir özelliktir, bu nedenle, etiketli bağışıklık hücrelerine (nötrofiller, makrofajlar ve T hücreleri) sahip transgenik zebra balığı çizgileri kullanarak, NASH ile ilişkili HCC larvalarında karaciğer bağışıklık hücresi kompozisyonunun nasıl analiz edileceğini de gösteriyoruz. Tarif edilen teknikler modele özgüdür ve karaciğer hastalığı progresyonunda karaciğer mikroçevresini ve bağışıklık hücresi kompozisyonunu değerlendirmek için son derece yararlıdır.
HCC’nin, özellikle NASH’nin indüklediği HCC’nin insidansının artmasıyla, NASH ile ilişkili HCC’de yer alan hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için daha verimli modellere sahip olmak büyük önem taşımaktadır. Karaciğerdeki hücre-hücre etkileşimlerinin dekonvolüsyonu, karaciğer hastalığının ilerlemesini ve hepatokarsinogenezi daha iyi anlamak için çok önemlidir. Bu protokolde açıklanan yaklaşım, karaciğer hastalığının ilerlemesini in vivo ve non-invaziv olarak analiz etmek için benzersiz bir yol sunmaktadır.
Diyetin hazırlanması, NASH ile ilişkili bir HCC modelinin oluşturulmasının başarısı için kritik öneme sahiptir. Zebra balığı için diyetler hazırlarken, zararlı etkilerden kaçınmak için dietil eterin duman davlumbazının içinde tamamen buharlaşmasına izin vermek önemlidir. Bu diyetleri larvalarla kullanmak için (döllenmeden 5-12 gün sonra), larvalar tarafından gıda alımını sağlamak için diyetleri ince parçacıklara öğütmek son derece önemlidir. Floresan etiketli yağ asidi analoglarının kullanımı, larvalarda gıda alımını değerlendirmek için kullanılabilir.
Larvaları üreme kutularına yerleştirmeden ve besleme prosedürüne başlamadan önce, larvaları farklı plakalardan karıştırarak deneysel örneklemenin üniforma haline getirilmesini sağlamak çok önemlidir. Bu adım önemlidir, çünkü 0. Gün’den başlayarak farklı mikro ortamlar plakaların her birinde teşvik edilir ve enflamatuar yanıtı etkileyebilir.
Bir diğer önemli adım, larvaları saymak, her beslenme kutusu için ne kadar yiyeceğe ihtiyaç duyulduğunu bilmektir. Yiyecek miktarı her kutuda bulunan larva sayısı için yeterli değilse, iki senaryodan biri gerçekleşecektir: 1) larvalar yetersiz beslenecektir; 2) larvalar aşırı beslenecektir. Yanlış beslenme, karaciğer mikro çevresini büyük ölçüde etkileyecek iltihaplanma gibi yetersiz beslenme veya aşırı beslenme ile ilişkili sağlıksız koşullara yol açacaktır. Yanlış beslenme meydana gelirse, larvalar hareket sorunları gösterecektir. Bu gelişim aşamasında, larvalar yoğun bir şekilde yüzmelidir, bu nedenle hareket sorunları fark edilirse larvalar sağlıksız koşullar altında (yetersiz beslenme veya aşırı beslenme nedeniyle toksik kolesterol dozlarına maruz kalma) ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, normal ve kolesterol bakımından zenginleştirilmiş her iki diyet için de beslenme prosedürlerinin sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerekir. Hepatomegali (karaciğer boyutu) varlığı ve doku ve organların, özellikle karaciğer ve bağırsağın iltihaplanması (nötrofillerin ve makrofajların gözle görülür şekilde artmış infiltrasyonu) dahil olmak üzere larvaların beslenmesinin ve sağlığının doğruluğunu hızlı bir şekilde ele almak için bazı testler yapılabilir.
E3’ün% 95’inin günlük temizliği ve değiştirilmesi, beslenme kutularındaki mikroorganizmaların büyümesini azaltmak ve larva sağlığını ve hayatta kalmasını iyileştirmek için çok önemlidir. Alternatif olarak, larvalar Bağımsız Raf Sistemine yerleştirilebilir. En iyi sonuç için, 3 litrelik bir tanka 60-80 larva yerleştirin. Akışı hızlı damlama moduna ayarlayarak ve larvaları günde iki kez 3-4 mg besleyerek (ve PM) su akışını minimum seviyede tutun. Her tankta doğru akışı sağlamak için su akışı düzenli olarak kontrol edilmelidir. Laboratuvarımızda bu yöntem %10 HCD’lik kısa süreli beslenme ile bize %95-100 sağkalım sağlamaktadır. Ek olarak, bu yöntem, açıklanan statik besleme protokolünde gerekli olan günlük temizlik ve su değişiminin doğasında bulunan iş yükünü büyük ölçüde azaltmıştır.
Kısa süreli maruziyette NASH’yi indüklemek için% 10 kolesterolle zenginleştirilmiş bir diyet kullanırken, (steatohepatiti indüklemek için 5 gün yeterlidir), fruktoz 18, yağ asitleri (Palmitik Asit gibi)19 veya % 4 kolesterolle zenginleştirilmiş bir diyet kullanılarak genişletilebilen beslenme protokolleri kullanmak için diyet değişiklikleri yapılabilir ve genişletilebilir20. Şu anda, HCC için az sayıda başarılı terapötik hedef vardır ve NASH için hiçbiri yoktur. Zebra balığı modellerinin kullanımı, hepatokarsinogenez hakkındaki bilgimizi genişletmek için eşsiz bir fırsatın yanı sıra büyük verim alan ilaç taramaları gerçekleştirmek için paralel olmayan bir omurgalı sistemi sunar. Bu protokolde açıklanan teknikler, karaciğer hastalığı ve hepatokarsinogenez için gelecekteki bulguları ve terapötik hedefleri kolaylaştıracaktır.
The authors have nothing to disclose.
Yazar, zebra balığı hatlarımızın yardımı ve bakımı için Albert Einstein Tıp Fakültesi Zebra Balığı Çekirdek Tesisi teknisyenleri Clinton DePaolo ve Spartak Kalinin’e teşekkür eder. FJMN, Kanser Araştırma Enstitüsü ve Fibrolameller Kanser Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Easily degraded. Store -20°C. |
Corning Netwells carrier kit 15 mm | Fisher | 07-200-223 | |
Corning Netwells inserts | Fisher | 07-200-212 | |
Diethyl ether | Fisher | 60-046-380 | Highly Volatile. |
Dumont forceps #55 dumostar | Fisher | NC9504088 | |
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in | Fisher | 22-183624 | |
4% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres | Brine Shrimp Direct | – | Any commercial dry powder food for larvae can be used. |
Graduated Transfer Pipets | Fisher | 22-170-404 | |
Isopropanol | Fisher | BP26181 | |
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack | Crystalgen | 221-1422-10 | |
Petri Dishes 100X20MM | Fisher | 08-747D | |
Tricaine | Sigma | A-5040 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
Oil Red O solution 0.5% isopropanol | Sigma | O1391-500ML | |
Tricaine | Sigma | A-5040 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
Vactrap | VWR | 76207-630 | Vacuum system for larvae collection |
Microscopes | |||
Fluorescent Stereomicroscope | Leica | M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large | |
Spinning Disk Confocal Microscope | Nikon | Nikon CSU-W1 | |
Stereomicroscope | Leica | S9i with transilluminated base | |
Software | |||
Fiji | Open-source Java image processing program. | ||
Imaris 9.6 | Bitplane; Oxford Instruments. |