Summary

Tumortransplantatie voor het beoordelen van de dynamiek van tumorinfiltrerende CD8 + T-cellen bij muizen

Published: June 12, 2021
doi:

Summary

Hier presenteren we een tumortransplantatieprotocol voor de karakterisering van tumor-inherente en periferie-afgeleide tumor-geïnfiltreerde lymfocyten in een muistumormodel. Specifieke tracering van de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen met flowcytometrie onthult de dynamiek van de fenotypische en functionele veranderingen van deze cellen tijdens antitumorimmuunresponsen.

Abstract

T-cel-gemedieerde immuniteit speelt een cruciale rol in immuunresponsen tegen tumoren, waarbij cytotoxische T-lymfocyten (CTL’s) de hoofdrol spelen bij het uitroeien van kankercellen. De oorsprong en aanvulling van tumorantigeenspecifieke CD8+ T-cellen in de tumormicro-omgeving (TME) blijven echter onduidelijk. Dit protocol maakt gebruik van de B16F10-OVA melanoom cellijn, die stabiel het surrogaat neoantigeen, ovalbumine (OVA) en TCR transgene OT-I muizen tot expressie brengt, waarin meer dan 90% van de CD8 + T-cellen specifiek het OVA-afgeleide peptide OVA257-264 (SIINFEKL) herkennen dat is gebonden aan het klasse I major histocompatibiliteitscomplex (MHC) molecuul H2-Kb. Deze kenmerken maken de studie van antigeenspecifieke T-celresponsen tijdens tumorigenese mogelijk.

Door dit model te combineren met tumortransplantatiechirurgie, werden tumorweefsels van donoren getransplanteerd in tumor-gematchte syngenetische ontvangermuizen om de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen in getransplanteerde donorweefsels nauwkeurig te traceren, waardoor de immuunresponsen van tumor-inherente en periferie-afkomstige antigeen-specifieke CD8 + T-cellen. Er bleek een dynamische overgang plaats te vinden tussen deze twee populaties. Gezamenlijk heeft dit experimentele ontwerp een andere benadering geboden om de immuunresponsen van CD8 + T-cellen in TME nauwkeurig te onderzoeken, wat nieuw licht zal werpen op de tumorimmunologie.

Introduction

CD8+ T-cel-gemedieerde immuunrespons speelt een cruciale rol bij het beheersen van tumorgroei. Tijdens tumorigenese worden naïeve CD8+ T-cellen geactiveerd bij antigeenherkenning op een MHC klasse I-beperkte manier en differentiëren vervolgens in effectorcellen en infiltreren in tumormassa 1,2. Binnen de tumormicro-omgeving (TME) drijven langdurige blootstelling aan antigeen, evenals immunosuppressieve factoren, geïnfiltreerde tumorspecifieke CD8 + T-cellen echter in een hyporesponsieve toestand die bekend staat als “uitputting”3. Uitgeputte T-cellen (Tex) onderscheiden zich van effector- of geheugen-T-cellen die worden gegenereerd bij acute virale infectie, zowel transcriptioneel als epigenetisch. Deze Tex-cellen worden voornamelijk gekenmerkt door de aanhoudende en verhoogde expressie van een reeks remmende receptoren en het hiërarchische verlies van effectorfuncties. Verder resulteert de verminderde proliferatieve capaciteit van uitgeputte CD8+ T-cellen in afnemende aantallen tumorspecifieke T-cellen, zodanig dat de resterende CD8+ T-cellen in de TME nauwelijks voldoende beschermende immuniteit tegen tumorprogressie kunnen bieden3. Het behoud of de versterking van intratumorale antigeenspecifieke CD8+ T-cellen is dus onmisbaar voor tumorrepressie.

Bovendien wordt aangenomen dat immuun checkpoint blokkade (ICB) therapie Tex in tumoren nieuw leven inblaast door de infiltratie van T-cellen en dus T-celaantallen te verhogen en T-celfuncties te verjongen om tumorrepressie te stimuleren. De wijdverspreide toepassing van ICB-behandeling heeft het landschap van kankertherapie veranderd, met een aanzienlijke subgroep van patiënten die duurzame responsenervaren 4,5,6. Toch reageren de meeste patiënten en kankersoorten niet of slechts tijdelijk op ICB. Ontoereikende T-celinfiltratie in de TME is gepostuleerd als een van de onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voorICB-weerstand 7,8.

Verschillende studies hebben de heterogeniteit van tumor-infiltrerende CD8+ T-cellen (TILs) aangetoond bij zowel patiënten als muismodellen 9,10,11,12. Het is bevestigd dat een subset van CD8 + T-cellen die T-celfactor-1 (TCF1) in een tumormassa tot expressie brengen, stamcelachtige eigenschappen vertoont, die verder aanleiding kunnen geven tot terminaal uitgeputte T-cellen en verantwoordelijk is voor de proliferatie-uitbarsting na ICB-therapie 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Het is echter bewezen dat slechts een klein deel van de antigeenspecifieke TCF1+CD8+ T-cellen in de TME aanwezig is en een uitgebreide pool van gedifferentieerde nakomelingen genereert als reactie op ICB 23,24,25,26. Of de beperkte omvang van deze populatie voldoende is om de persistentie van cytotoxische T-lymfocyten (CTL’s) te garanderen om tumorprogressie onder controle te houden, blijft onbekend en of er aanvulling is vanuit periferieweefsels vereist verder onderzoek. Bovendien suggereert recent onderzoek de onvoldoende revitaliseringscapaciteit van reeds bestaande tumorspecifieke T-cellen en het verschijnen van nieuwe, voorheen niet-bestaande clonotypen na anti-geprogrammeerde celdoodeiwit 1-behandeling. Dit geeft aan dat de T-celrespons op checkpointblokkade te wijten kan zijn aan de nieuwe instroom van een duidelijk repertoire van T-celklonen27. Samen met de aanwezigheid van omstanders niet-tumor-reactieve cytotoxische T-celfractie in de TME, leidden deze bevindingen tot de oprichting van een tumor allograftmodel om de rol van periferie-afgeleide CD8 + T-cellen11 te bestuderen.

Tot nu toe werden verschillende soorten tumorimplantatie, evenals immuuncel adoptieve overdracht, op grote schaal gebruikt op het gebied van tumorimmunologie28. TILs, perifere mononucleaire bloedcellen en tumorreactieve immuuncellen afkomstig uit andere weefsels kunnen goed worden gekarakteriseerd met behulp van deze methoden. Bij het bestuderen van de interacties tussen systemische en lokale antitumorimmuniteit lijken deze modellen echter ontoereikend om de interacties tussen immuuncellen afgeleid van de periferie en de TME te onderzoeken. Hier werden tumorweefsels getransplanteerd van donoren in tumor-gematchte ontvangermuizen om de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen nauwkeurig te traceren en de van de donor afgeleide cellen in de TME tegelijkertijd te observeren.

In deze studie werd een murine syngenetisch model van melanoom vastgesteld met de B16F10-OVA melanoom cellijn, die stabiel het surrogaat neoantigeen ovalbumine tot expressie brengt. TCR transgene OT-I muizen, waarbij meer dan 90% van de CD8+ T cellen specifiek het OVA-afgeleide peptide OVA257-264 (SIINFEKL) herkennen gebonden aan het klasse I MHC molecuul H2-Kb, maken de studie van antigeenspecifieke T-celresponsen mogelijk die zijn ontwikkeld in het B16F10-OVA tumormodel. Door dit model te combineren met tumortransplantatie, werden de immuunresponsen van tumor-inherente en periferie-afkomstige antigeen-specifieke CD8 + T-cellen vergeleken om een dynamische overgang tussen deze twee populaties te onthullen. Gezamenlijk heeft dit experimentele ontwerp een andere benadering geboden om de immuunresponsen van CD8 + T-cellen in de TME nauwkeurig te onderzoeken, wat nieuw licht werpt op de dynamiek van tumorspecifieke T-celimmuunresponsen in de TME.

Protocol

Alle muisexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutionele Dierverzorgings- en Gebruikscommissies van de Derde Militaire Medische Universiteit. Gebruik 6-8 weken oude C57BL/6 muizen en naïeve OT-I transgene muizen met een gewicht van 18-22 g. Gebruik zowel mannelijk als vrouwelijk zonder randomisatie of ‘verblinding’. 1. Bereiding van medium en reagentia Bereid celkweekmedium D10 zoals eerder beschreven29 door 10% foet…

Representative Results

Het schema van dit protocol is weergegeven in figuur 1. Acht dagen na tumorinenting werden CD45.1+ en CD45.1+CD45.2+ OT-I cellen geïnjecteerd in B16F10-OVA tumordragende C57BL/6 muizen. De tumor werd chirurgisch ontleed van CD45.1+ OT-I celgeïmplanteerde muizen (donor) op dag 8 na de overdracht en getransplanteerd in tumor-gematchte CD45.1+CD45.2+ OT-I celgeïmplanteerde muizen (ontvanger) in de dorsale flank aan dezelfde ka…

Discussion

T-cel-gemedieerde immuniteit speelt een cruciale rol in immuunresponsen tegen tumoren, waarbij CTL’s de hoofdrol spelen bij het uitroeien van kankercellen. De oorsprong van tumorantigeenspecifieke CTL’s binnen TME is echter niet opgehelderd30. Het gebruik van dit tumortransplantatieprotocol heeft een belangrijke aanwijzing gegeven dat intratumorale antigeenspecifieke CD8 + T-cellen mogelijk niet lang blijven bestaan, ondanks het bestaan van stamachtige TCF1 + voorloper CD8 <s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door subsidies van het National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (nr. 31825011 tot LY) en de National Natural Science Foundation of China (nr. 31900643 tot QH, nr. 31900656 tot ZW).

Materials

0.22 μm filter Millipore SLGPR33RB
1 mL tuberculin syringe KDL BB000925
1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences 320310
15 mL conical tube BEAVER 43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma T48402-25G
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML
70 μm nylon cell strainer BD Falcon 352350
APC anti-mouse CD45.1 BioLegend 110714 Clone:A20
B16F10-OVA cell line bluefbio BFN607200447
BSA-V (bovine serum albumin) Bioss bs-0292P
BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 BD Horizon 562895 Clone:104
cell culture dish BEAVER 43701/43702/43703
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R
cyclophosphamide Sigma C0768-25G
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco C11995500BT
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19853
EDTA Sigma EDS-500g
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science R510-22-16
KHCO3 Sangon Biotech A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation Life Technologies L10199
needle carrier RWD Life Science F31034-14
NH4Cl Sangon Biotech A501569-0500
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002
surgical forceps RWD Life Science F12005-10
surgical scissors RWD Life Science S12003-09
suture thread RWD Life Science F34004-30
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml

References

  1. Blank, C. U., et al. Defining ‘T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
  2. Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
  3. McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
  4. Davis, M. M., Brodin, P. Rebooting human immunology. Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
  7. Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
  8. Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
  9. Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
  10. Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
  11. Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
  12. Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
  13. Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
  14. Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
  15. Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
  16. Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
  17. Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
  18. Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
  19. Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
  20. Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
  21. Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
  22. E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
  23. Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
  24. Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
  25. Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
  26. Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
  27. Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
  28. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  29. Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
  30. Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
  31. Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
  32. Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
  33. Thorsson, V., et al. The Immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).

Play Video

Cite This Article
Wang, L., Wang, Z., Guo, J., Lin, H., Wen, S., Liu, Q., Li, Y., Wu, Q., Gao, L., Chen, X., Xie, L., Tian, Q., Tang, J., Li, Z., Hu, L., Wang, J., Xu, L., Huang, Q., Ye, L. Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. J. Vis. Exp. (172), e62442, doi:10.3791/62442 (2021).

View Video