Summary

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

Published: February 12, 2022
doi:

Summary

Aus Maushepatozyten wurde ein langfristiges Ex-vitro-3D-Organoidkultursystem etabliert. Diese Organoide können durch Lentivirus-Infektion der shRNA /ektopischen Konstruktion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9-Engineering durchpasst und genetisch manipuliert werden.

Abstract

Die Leber ist das größte Organ bei Säugetieren. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Glukosespeicherung, der Proteinsekretion, dem Stoffwechsel und der Entgiftung. Als Vollstrecker für die meisten Leberfunktionen haben primäre Hepatozyten eine begrenzte Proliferationskapazität. Dies erfordert die Etablierung von ex vivo Hepatozytenexpansionsmodellen für die leberphysiologische und pathologische Forschung. Hier isolierten wir murine Hepatozyten durch zwei Schritte der Kollagenase-Perfusion und etablierten eine 3D-Organoidkultur als “Mini-Leber”, um Zell-Zell-Interaktionen und physikalische Funktionen zu rekapitulieren. Die Organoide bestehen aus heterogenen Zellpopulationen, einschließlich Vorläufern und reifen Hepatozyten. Wir stellen den Prozess im Detail vor, um die murinen Hepatozyten oder fetalen Hepatozyten zu isolieren und zu kultivieren, um innerhalb von 2-3 Wochen Organoide zu bilden und zu zeigen, wie man sie durch mechanisches Pipettieren auf und ab durchläuft. Darüber hinaus werden wir auch vorstellen, wie die Organoide in einzelne Zellen für die Lentivirus-Infektion der shRNA / ektopischen Konstruktion, die siRNA-Transfektion und das CRISPR-Cas9-Engineering verdaut werden können. Die Organoide können für Drogenscreenings, Krankheitsmodellierung und grundlegende Leberforschung verwendet werden, indem Leberbiologie und Pathobiologie modelliert werden.

Introduction

Organoide sind selbstorganisierte, dreidimensionale (3D) In-vitro-Cluster, die selbsterneuernde Stammzellen und mehrliniendifferenzierte Zellen umfassen1,2. Die Organoide vieler Organe wurden entweder aus pluripotenten oder adulten Stammzellen durch genau definierte Nischenfaktoren wie Darm, Gehirn, Dickdarm, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Schilddrüse, Magen, Haut und Lunge hergestellt3,4,5,6,7 . Die Organoide rekapitulieren physikalische Zellfunktionen, indem sie entweder die Entwicklung (entstanden aus embryonalen oder induzierten pluripotenten Stammzellen, PSCs) oder die Homöostase/Regenerationsprogression (entstanden aus adulten Stammzellen, ASCs) nachahmen, was neue Wege in der Krankheitsforschung und -therapie eröffnet8,9.

Als größtes Organ bei Säugetieren ist die Leber vor allem für die Speicherung, den Stoffwechsel und die Entgiftung verantwortlich. Zwei Arten von Epithelzelltypen, Hepatozyten und Cholangiozyten, konstruieren die Grundeinheit eines Leberläppchens. Hepatozyten sind für 70-80% der Leberfunktion verantwortlich10. Obwohl die Leber eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit aufweist, kommt es während der traditionellen Monolayer-Kultivierung durch dysregulierte Zellpolarisation und -dedifferenzierung zu einem schnellen Verlust von Hepatozytenmerkmalen, was die Notwendigkeit von Forschern und Klinikern erhöht, “lückenüberbrückende” Lebermodelle in einer Schale zu erstellen. Bis vor kurzem waren die Ex-vivo-Expansionsmodelle von primären Hepatozyten jedoch nicht gut etabliert11,12,13,14,15. Leberorganoide können aus embryonalen/induzierten pluripotenten Stammzellen, Fibroblastenumwandlung in hepatozytenähnliche Zellen und gewebeabgeleiteten Zellen hergestellt werden. Die Entwicklung von Leberorganoiden fördert die Anwendung eines In-vitro-Modells für Arzneimittelscreenings und Lebertoxizitätstests16,17.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Etablierung von Leberorganoiden aus murinen primären Hepatozyten. Mit diesem Protokoll haben wir ein In-vitro-Kultursystem aus Hepatozyten-Organoiden mit zwei Kollagenase-Perfusionen aufgebaut. Diese Organoide können für eine langfristige Expansion für Monate durchquert werden. Ihre physiologische Funktion ist sehr konsistent mit Hepatozyten. Darüber hinaus bieten wir auch eine detaillierte Beschreibung der Durchführung von Genmanipulationen, wie Lentivirus-Infektion, siRNA-Transduktion und CRISPR-Cas9-Engineering mit Organoiden. Die Vermehrung von Hepatozyten-Organoiden beleuchtet die Möglichkeit, Organoide zu verwenden, um die Leberbiologie zu verstehen und personalisierte und translationale medizinische Ansätze zu entwickeln.

Protocol

Alle Mäuseexperimente wurden vom Animal Care and Use Committee der School of Basic Medical Sciences an der Shandong University genehmigt und gemäß der Lizenz gemäß den Richtlinien und Vorschriften des Innenministeriums (Nr. ECSBMSSDU2019-2-079). HINWEIS: Dieses Protokoll wird hauptsächlich verwendet, um 3D-Organoide aus isolierten primären Hepatozyten zu kultivieren. 1. Etablierung der Murinen Hepatozyten-Organoidkultur HINWEIS: Extr…

Representative Results

Die Hepatozyten-Organoide von weiblichen Alb-Cre; Rosa26-GFP-Maus (8 Wochen) wurde fünf Tage nach der Aussaat beobachtet (Abbildung 1A). Die Organoide vermehren sich mit Ki67-positiver Färbung (Abbildung 1B). Die interferierende Expression repräsentativer Gene in Hepatozyten-Organoiden entweder durch siRNA-Transfektion oder Lentivirus-Infektion wurde mittels qRT-PCR und Western Blot untersucht. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 2A</s…

Discussion

Die Fähigkeit, reife Hepatozyten über lange Zeiträume zu kultivieren, ist von grundlegender Bedeutung für das Studium der Lebergrundforschung, der Arzneimitteltoxikologie und der hepatotropen Wirtsmikrobiologie-Infektionen wie Malaria und Hepatitis-Viren. Mit einer klar definierten Nische richtet das Protokoll hier ein Kultursystem für Hepatozyten ein. Dieses Protokoll treibt reife Hepatozyten dazu, sich in 3D-Kultur mit einer Heterogenität auszudehnen, die die Zell-Zell-Interaktion, die meisten Hepatozytenfunktion…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Professor Hans Clevers für die freundliche Bereitstellung der Zelllinien zur Herstellung von rekombinantem R-Spondin1. Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), der National Natural Science Foundation of China (31970779) an H.H. und der Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group der Shandong University (2020QNQT003) an H.H. unterstützt.

Materials

Perfusion Buffer
EGTA Sangon Bitech A600077-0100 3.50 g/L
Glucose Sangon Bitech A100188-0500 9.00 g/L
KCl Sangon Bitech A100395-0500 4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O Sangon Bitech A501727-0500 1.51 g/L
NaCl Sangon Bitech A501218-0001 80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O Sangon Bitech A610404-0500 0.78 g/L
NaHCO3 Sangon Bitech A500873-0500 3.50 g/L
Phenol Red Sangon Bitech A100882-0025 0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2 Sangon Bitech A501330-0005 0.50 M
Collagenase IV Sigma C1639 0.10 mg/mL
HEPES Sangon Bitech C621110-0010 23.80 g/L
KCl Sangon Bitech A100395-0500 4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O Sangon Bitech A501727-0500 1.51 g/L
NaCl Sangon Bitech A501218-0001 80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O Sangon Bitech A610404-0500 0.78 g/L
NaHCO3 Sangon Bitech A500873-0500 3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum Gibco 10091148 stored at 4 °C
DPBS Gibco C14190500BT0 stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 stored at 4 °C
GlutaMAX Gibco 35050-061 100 X
HEPES Gibco 15630-080 100 X
Penicillin/streptomycin Sangon Bitech  A600135-0025 100 X
Culture Medium
A83-01 Tocris 2939 Stock concentration 500 µM, final
concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A Gibco 1704-044 50 X
Chir 99021 Tocris 4423 Stock concentration 30 mM, final
concentration 3 µM
DMEM/F12 Gibco 11330032 stored at 4 °C
Gastrin I Tocris 3006 Stock concentration 100 mM, final
concentration 10 nM
GlutaMAX Gibco 35050-061 100 X
HEPES Gibco 15630-080 100 X
Matrigel martix BD 356231 stored at -20 °C
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Stock concentration 500 mM, final
concentration 1 mM
Nictinamide Sigma Aldrich N0636 Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin Sangon Bitech  A600135-0025 100 X
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10 Peprotech 100-26 Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α Peprotech 100-16A Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α Origene TP750007-1000 Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632 Abmole Bioscience Y-27632 dihydrochloride Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter Millipore SCGPT01RE
16 # silicone tube LangerPump
24 well, suspension Greiner bio-one GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter BD 352350
Accutase stemcell AT-104 stored at 4 °C
Anti-CTNNB1 BD 610154 Mouse
Anti-GAPDH CST 5174S Rabbit
Anti-HDAC7 Abcam ab50212 Mouse
Anti-KI67 Abcam ab15580 Rabbit
Biological safety cabinet ESCO CCL-170B-8
Cell Recovery Solution Corning 354253 stored at 4 °C
Centrifuge 5430 eppendorf 542700097
CO2 incubator ESCO AC2-4S1
DMSO Sangon Bitech  A100231 stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems Invitrogen AME4300
Hdac3 siRNA Guangzhou RiboBio Co., Ltd. siG2003180909192555 stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd LV2020-2364 stored at -80 °C
Hitrans G A Shanghai Genechem Co.,Ltd. REVG004 Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen 13778150 Increased virus infection efficiency
Live cell dye Luna F23001 stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge cence TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device Lonza
Opti-MEM Gibco 31985070 stored at 4 °C
Pasteur pipette Sangon Bitech F621006-0001
Peristaltic pump LangerPump BT100-2J
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Activate with methanol
PX458 Addgene 48138 stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge Thermo Scientific Heraeus Labofuge 400
RSL3 MCE HY-100218A Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA Gibico 25200072 stored at 4 °C
Wee1 siRNA Guangzhou RiboBio Co., Ltd. siG2003180909205971 stored at -20 °C

References

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Cite This Article
Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids. J. Vis. Exp. (180), e62438, doi:10.3791/62438 (2022).

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