Культивирование CTC позволяет более глубокой функциональной характеристике рака путем анализа экспрессии конкретных маркеров и оценки лекарственной устойчивости и способности колонизировать печень среди других возможностей. В целом, культура CTC может стать многообещающим клиническим инструментом для персонализированной медицины для улучшения результатов лечения пациентов.
Метастазирование является основной причиной смерти от рака. Несмотря на улучшения в стратегиях лечения, метастатический рак имеет плохой прогноз. Таким образом, мы сталкиваемся с настоятельной необходимостью понять механизмы развития метастазирования и, таким образом, предложить эффективные методы лечения прогрессирующего рака. Метастатический рак трудно поддается лечению, так как биопсия инвазивна и недоступна. В последнее время наблюдается значительный интерес к жидким биопсиям, включая как бесклеточную циркулирующую дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), так и циркулирующие опухолевые клетки из периферической крови, и мы установили несколько циркулирующих линий опухолевых клеток у пациентов с метастатическим колоректальным раком для участия в их характеристике. Действительно, чтобы функционально охарактеризовать эти редкие и плохо описанные клетки, решающим шагом является их расширение. После установления линии циркулирующих опухолевых клеток (CTC) могут быть культивированы в условиях суспензии или приверженности. На молекулярном уровне линии CTC могут быть дополнительно использованы для оценки экспрессии специфических маркеров, представляющих интерес (таких как дифференцировка, эпителиальные или раковые стволовые клетки) с помощью иммунофлуоресцентного или цитометрического анализа. Кроме того, линии CTC могут использоваться для оценки чувствительности лекарств к химиотерапии золотого стандарта, а также к таргетной терапии. Способность линий CTC инициировать опухоли также может быть проверена путем подкожной инъекции CTC у иммунодефицитных мышей.
Наконец, можно проверить роль специфических генов, представляющих интерес, которые могут быть вовлечены в распространение рака, путем редактирования генов CTC с помощью короткой шпильки рибонуклеиновой кислоты (шРНК) или Crispr / Cas9. Таким образом, модифицированные CTC могут быть введены в иммунодефицитную селезенку мышей, чтобы экспериментально имитировать часть процесса метастатического развития in vivo.
В заключение, линии CTC являются ценным инструментом для будущих исследований и для персонализированной медицины, где они позволят прогнозировать эффективность лечения с использованием тех самых клеток, которые изначально ответственны за метастазирование.
Несмотря на недавние улучшения в ранней диагностике рака и в терапевтической стратегии, более девяноста процентов заболеваемости раком по-прежнему связано с метастазированием1. Метастатический процесс представляет собой многоступенчатый каскад, который начинается с локальной отслойки клеток от первичной опухоли и их поступления в кровоток, где они становятся циркулирующими опухолевыми клетками (ЦОК), чтобы окончательно колонизировать отдаленные участки, такие как печень и легкие, в случае колоректального рака (CRC)2. В последнее время растет внимание к жидким биопсиям, которые являются неинвазивным инструментом для выявления и перечисления ЦОК из образцов крови пациентов. Внутриопухолевая генетическая гетерогенность является основной причиной лекарственной устойчивости; таким образом, выделение репрезентативных клеток из опухолевого материала представляет собой перспективный инструмент персонализированноймедицины3.
Несмотря на низкую частоту ЦОК в крови (1 ЦПК на 106 – 107 лейкоцитов)4,было разработано несколько методик обнаружения и выделения, основанных на различиях свойств между ЦОК и другими компонентами крови5. Количество ЦОК в образцах крови пациента, само по себе, может дать информацию о стадии злокачественности, реакции на лечение и прогрессировании заболевания6,7. Таким образом, изоляция CTC является важнейшим инструментом для трансляционных исследований для оценки генетической гетерогенности или проведения скрининга лекарств, а также для фундаментальных исследований для характеристики этих инвазивных клеток, поскольку они являются ключевыми субъектами метастатической индукции8,9. Действительно, по сравнению с коммерчески установленными линиями раковых клеток, которые накопили тысячи мутаций с течением времени, свежие ЦОК разделяют основные особенности исходной первичной опухоли, включая мощную способность метастазировать, и они являются лучшим отражением заболевания. Эти особенности делают их надежным инструментом для фундаментальных исследований, особенно в нокаут-экспериментах с предсказанными ключевыми факторами, участвующими в метастазировании. Результат этих экспериментов может быть подтвержден in vivo,на мышах, как описано ниже.
Как только ЦОК выделены, они могут быть расширены в условиях неадгезивной культуры, а затем ими можно манипулировать так же, как и любой доступной линией раковых клеток, то есть они могут быть в равной степени культивированы в условиях адгептации или встроены в Matrigel, в зависимости от научного вопроса10. Например, чтобы проверить экспрессию и локализацию интересующего белка, сферы CTC могут быть выращены в состоянии суспензии и встроены в гистоген для выполнения иммунофлуоресценции на участках сферы. Кроме того, если белок мембранный, его экспрессию на живых клетках можно измерить с помощью цитометрии.
Для функциональных исследований, чтобы проверить роль интересующего белка, который может играть роль в колонизации печени, CTC с генами, отредактированными шРНК или CRISPR / Cas9, могут быть введены в селезенку иммунодефицитных мышей. Этот последний эксперимент является мощной моделью для имитации колонизации метастазов в печень11.
Способность ЦОК инициировать опухоли может быть оценена путем введения очень небольшого количества клеток мышам с иммунодефицитом. Поскольку инициация опухоли является отличительной чертой раковых стволовых клеток (CSC), этот анализ будет указывать на процент CSC в линиях CTC. Этот фенотип стволовых клеток делает циркулирующие линии опухолевых клеток устойчивыми к некоторым методам лечения рака золотого стандарта. Таким образом, расширенные ЦОК могут использоваться для скрининга лекарств и определения наилучшего потенциально эффективного лечения для пациента; Реакция CTC на лечение может быть проверена in vitro с использованием, например, анализа жизнеспособности люминесценции.
В долгосрочной перспективе скрининг лекарств на свежеизолированных и усиленных ЦОК может быть использован в качестве нового инструмента персонализированной медицины, чтобы помочь в выборе наиболее эффективного и адаптированного лечения для пациентов.
В настоящем документе подробно описаны протоколы культивирования линий CTC, окрашивания специфических белков с помощью иммуноокрашивания и цитометрии, проведения анализов цитотоксичности, а также экспериментов in vivo с ксенотрансплантатами с CTC.
Протокол, описанный выше, первоначально использовался для функциональной характеристики колоректального CTC, но он может быть использован для других типов рака, таких как рак молочной железы, и может быть адаптирован для мышиных моделей.
Реальным ограничивающим фактором…
The authors have nothing to disclose.
Этот исследовательский проект в лаборатории Pannequin был поддержан исследовательским грантом SIRIC: Грант «INCa-DGOS-Inserm 6045». Кандидатские диссертации Гийома Бельтье и Зейнаба Хомаида были поддержаны противораковой лигой / Ligue contre le Cancer. Зарплата Селин Булье финансировалась «регионом Окситания». Спасибо Джулиану Венейблсу за редактирование на английском языке.
Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |