Echtzeit-Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies bei Neutrophilen, die mit Meningitic Escherichia Coli infiziert sind
Summary
Escherichia coli ist die Hauptursache für neonatale Gram-negative bakterielle Meningitis. Während der bakteriellen Infektion spielen reaktive Sauerstoffspezies, die von Neutrophilen produziert werden, eine wichtige bakterizide Rolle. Hier führen wir eine Methode zum Nachweis der reaktiven Sauerstoffspezies in Neutrophilen als Reaktion auf Meningitis E. coliein.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) ist die häufigste gramnegative Bakterien verursacht neonatale Meningitis. Das Auftreten von Bakteriämie und bakterielle Penetration durch die Blut – Hirn-Schranke sind unverzichtbare Schritte für die Entwicklung von E. coli Meningitis. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) stellen die wichtigsten bakteriziden Mechanismen von Neutrophilen dar, um die eingedrungenen Krankheitserreger zu zerstören. In diesem Protokoll wurde die zeitabhängige intrazelluläre ROS-Produktion bei Neutrophilen, die mit meningitischem E. coli infiziert waren, mit fluoreszierenden ROS-Sonden quantifiziert, die von einem Echtzeit-Fluoreszenz-Mikroplattenleser nachgewiesen wurden. Diese Methode kann auch auf die Beurteilung der ROS-Produktion in Säugetierzellen während der Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und Wirt angewendet werden.
Introduction
Neonatale bakterielle Meningitis ist eine häufige pädiatrische Infektionskrankheit. Escherichia coli (E. coli) mit einer K1-Kapsel ist der häufigste gramnegative Erreger, der eine neonatale bakterielle Meningitis verursacht und etwa 80% der Gesamtinzidenz1,2,3ausmacht. Trotz der Fortschritte in der antimikrobiellen Chemotherapie und unterstützenden Pflege ist die bakterielle Meningitis immer noch eine der verheerendsten Erkrankungen mit hoher Morbidität und Mortalität4.
Das Auftreten der neonatalen bakteriellen Meningitis beginnt in der Regel mit Bakteriämie, die durch das Eindringen pathogener Bakterien in den peripheren Kreislauf aus den lokalen Läsionen der Neugeborenen verursacht wird, gefolgt von der Penetration durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in das Gehirn, was zu einer Entzündung der Hirnhaut4führt. Der Beginn der Bakteriämie hängt von der Interaktion zwischen Bakterien und Wirtsimmunzellen einschließlich Neutrophilen und Makrophagen usw. ab. Neutrophile, die für 50-70% der weißen Blutkörperchen ausmachen, sind die erste Verteidigungslinie gegen bakterielle Infektionen5,6. Während der Invasion von Bakterien werden die aktivierten Neutrophilen an die infektiösen Stellen rekrutiert und geben reaktive Sauerstoffspezies (ROS) frei, einschließlich des Superoxid-Anions, Wasserstoffperoxids, Hydroxylradikalen und Singlet-Sauerstoff7. Die ROS durchlaufen Redox-Reaktionen mit der Zellmembran, Nukleinsäuremolekülen und Proteinen der Bakterien, was zu Verletzungen und Zum Tod der eindringenden Bakterien8führt. Die Mitochondrien sind der Hauptstandort der ROS-Produktion in eukaryotischen Zellen, und verschiedene Oxidasen (z.B. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH) Oxidase-Komplex, Lipoxygenase-System, Proteinkinase C und Cyclooxygenase-System) vermitteln die Produktion von ROS9,10. Die Echtzeitmessung der Produktion von ROS, die den primären antimikrobiellen Mechanismus in Neutrophilen darstellt, ist eine nützliche Methode, um die Wirtsabwehr während der Bakterien-Wirt-Interaktion zu untersuchen.
In diesem Protokoll wurde die zeitabhängige ROS-Produktion bei Neutrophilen, die mit meningitischem E. coli infiziert waren, mit einer fluoreszierenden ROS-Sonde DHE quantifiziert, die von einem Echtzeit-Fluoreszenz-Mikroplattenleser nachgewiesen wurde. Diese Methode kann auch auf die Beurteilung der ROS-Produktion in anderen Säugetierzellen während der Pathogen-Wirt-Interaktion angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neutrophile fungieren als die am häufigsten vorkommende Komponente der weißen Blutkörperchen in der menschlichen Blutzirkulation. Sie sind wichtige Effektorzellen im angeborenen menschlichen Immunsystem, das die erste Verteidigungslinie gegen die Invasion von Krankheitserregern baut11. Die Erzeugung von ROS stellt einen der wichtigsten bakteriziden Mechanismen von Neutrophilen nach Phagozytose11dar. Jüngste Studien haben gezeigt, dass eine netzähnliche Struktur, die vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) und dem Program of Distinguished Professor of Liaoning Province (LJH2018-35) unterstützt.
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
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