Hier wordt een goedkoop, toegankelijk protocol beschreven om het herstel van koude schokken van vlinders onder omgevingsomstandigheden te evalueren.
Ecologische fysiologie, met name van ectothermen, wordt steeds belangrijker in deze veranderende wereld, omdat het metingen van soorten en omgevingskenmerken gebruikt om de interacties tussen organismen en hun omgeving te verkennen om hun overleving en fitheid beter te begrijpen. Traditionele thermische assays zijn duur in termen van tijd, geld en apparatuur en zijn daarom vaak beperkt tot kleine steekproefgroottes en weinig soorten. Hier wordt een nieuw protocol gepresenteerd dat gedetailleerde gegevens genereert over individueel gedrag en fysiologie van grote, voluminante, terrestrische insecten, met behulp van het voorbeeld van vlinders. Dit artikel beschrijft de methoden van een koude schokhersteltest die in het veld kan worden uitgevoerd onder omgevingsomstandigheden en waarvoor geen dure laboratoriumapparatuur nodig is. Deze methode is gebruikt om de respons- en herstelstrategie op koude schokken van tropische vlinders te begrijpen en individuele gegevens te genereren over hele vlindergemeenschappen. Deze methoden kunnen zowel in afgelegen veldomgevingen als klaslokalen worden gebruikt en kunnen worden gebruikt om ecologisch relevante fysiologische gegevens te genereren en als leermiddel.
De integratie van thermische fysiologie en ecologie in de late jaren 1970 en begin jaren 19801,2 lanceerde het gebied van ecologische fysiologie. Uitgebreide thermische studies uitgevoerd op ectothermen benadrukken ecologisch-fysiologische synergieën in verschillende eco-evolutionaire contexten3,4,5. Onderzoek naar thermische fysiologie van ectothermische organismen heeft onlangs de aandacht herwonnen in het licht van klimaatverandering en veranderde thermische landschappen over de hele wereld6,7. Naast het informeren van studies op academisch gebied van ecologische fysiologie, kunnen thermische fysiologietesten breed toegankelijk zijn voor onderzoekers en kunnen ze dienen als een praktische onderwijsaanpak voor alle niveaus. Componenten van thermische prestaties, waaronder thermische limieten en effecten van temperatuurschokken, zijn fundamenteel voor de ecologie, het gedrag en de levensgeschiedenis van dieren8,9.
In het bijzonder worden ecotothermen gebruikt om vragen over fysiologie aan te pakken, omdat endothermie een onlosmakelijk verband tussen omgevingstemperatuur en organismetemperatuur dicteert. Het temperatuurbereik dat organismen kunnen weerstaan (hun kritische thermische minimum tot maximaal thermisch bereik) en de temperaturen waarbij hun gedrag en geschiktheid worden gemaximaliseerd (thermische optima) zijn vaak geworteld in ecologische en evolutionaire processen. Deze fysiologische eigenschappen zijn van toenemend belang omdat temperaturen, zowel middelen als extremen, toenemen10. De abiotische veranderingen, waaronder temperatuurstijgingen, die gepaard gaan met habitatvernietiging en fragmentatie hebben bijvoorbeeld gemeenschappen van ectothermen, waaronder anuranen, beïnvloed, waardoor fysiologisch kwetsbare soorten (met smalle thermische tolerantie) worden beperkt tot kleine restgebieden van de habitat11,12.
Het beoordelen van belangrijke componenten van thermische prestaties kan duur zijn, zowel in termen van tijd als middelen en vereist traditioneel laboratoriumapparatuur en gestandaardiseerde omstandigheden. Bovendien weerspiegelen conventionele assays vaak niet de breedte van de omgevingsomstandigheden die een bepaald dier in de natuur13 eert, aangezien de temperatuur in vergelijkbare fysiologie-experimenten zorgvuldig wordt gecontroleerd en vaak geen verband houdt met omgevingsomstandigheden die een dier maakt. Deze temperatuurregeling kan het begrip van variatie in individuele reactiesverminderen 2,14. Fysiologen hebben vertrouwd op laboratoriumgebaseerde verwarmings- en koelingsexperimenten, met behulp van programmeerbare waterbaden om de omgeving van een dier gestaag te verwarmen of te koelen om thermische prestatiecurven te informeren15.
Meestal worden dieren in flacons met een thermokoppel geplaatst en wordt hun omgevingstemperatuur gestaag gewijzigd door de temperatuur van het omringende waterbad te regelen. Onderzoekers meten de tijd die nodig is om een veranderde fysiologische toestand te bereiken (bijv. chill coma, knockdown) en de temperatuur waarbij de statusverandering plaatsvond16,17. Vanaf een minimum van USD $ 500 zijn deze gereedschappen groot, zwaar en vereisen ze extra technische apparatuur (bijv. computer, thermokoppels). Bijgevolg zijn de basisinstrumenten voor het uitvoeren van klassieke methoden voor de beoordeling van thermische prestaties 1) economisch niet voor iedereen toegankelijk, 2) niet geschikt voor het testen van dieren die te groot zijn om te worden opgenomen in gebruikelijke flacons die worden gebruikt voor kleine dipterans, en 3) niet draagbaar voor gebruik in afgelegen veldinstellingen. De naleving van de gangbare praktijk heeft geresulteerd in een beperkte vertegenwoordiging in taxonomie en experimentele omstandigheden18,19,20.
Hoewel volledige thermische prestatiecurven de verspreiding van soorten, levensgeschiedeniskenmerken en gedrag kunnen informeren, kan de kwantificering van minder en eenvoudigere thermische statistieken efficiënter en nog steeds uiterst informatief zijn. Fysiologische assays, het meten van het begin van de koude coma en het daaropvolgende herstel van koude schokken, koudeharding en rechtzettend gedrag, zijn effectieve en uitvoerbare proxy’s voor het kritische thermische minimum van een organisme8. Hier beschreven is een koude schoktest nuttig voor het opwekken van fysiologische gegevens van grote terrestrische ectothermische insecten. De test is betaalbaar, toegankelijk en gemakkelijk uit te voeren onder veldomstandigheden of in de klas. Gegevens over koude schokherstel die door dit protocol worden gegenereerd, kunnen worden gekoppeld aan soort- of individuele eigenschapsgegevens om vragen over ecologische fysiologie na te streven en / of worden gebruikt om studenten te leren over fysiologische principes.
De studie van thermische fysiologie omvat metingen van soorten en omgevingskenmerken om de interacties tussen organismen en hun omgeving die essentieel zijn voor overleving en fitheid beter te begrijpen. Hoewel ze altijd een integraal onderdeel zijn van het begrijpen van de natuurlijke geschiedenis en ecologie van planten en dieren , zijn thermische eigenschappen van toenemend belang in het licht van landschap en klimaatverandering11,21. Verschillende groepen ectothermische terrestrische insecten, in het bijzonder lepidoptera en odonatan, zijn relatief groot en overvloedig, vertonen duidelijk gedrag en zijn vatbaar voor manipulatie. Hier wordt een efficiënte en goedkope test beschreven om fysiologische reacties van dergelijke insecten effectief te meten. Dit protocol vereist een bron van gezonde organismen om te assay, waarvan de verwerkingstijd voorafgaand aan het experiment beperkt is. Hoewel het aantal onderzochte organismen in één keer flexibel is, zal het aantal focale individuen per experiment variëren op basis van het doel van de gegevensverzameling en/of het aantal waarnemers.
Dit protocol is bijvoorbeeld ontwikkeld om gedetailleerde individuele gegevens over vlinders in hele gemeenschappen te verzamelen. Als zodanig illustreren de representatieve resultaten een inspanning om de gegevensverzameling voor individuen van zoveel mogelijk soorten en onder verschillende omstandigheden die relevant zijn voor de lokale omgeving te maximaliseren. Ongeacht het aantal focale soorten is het van cruciaal belang dat de waarnemer elk individu in de kooi kan identificeren dat het herstel ervaart. Als het doel is om gegevens van slechts één soort te verzamelen, moeten slechts één of twee personen (indien identificeerbaar op basis van verschillende vleugelslijtage of indien individueel gemarkeerd) in één keer worden geïdentificeerd. De proefpersonen moeten worden gekozen in overeenstemming met een specifieke onderzoeksvraag of studieplan. Op basis van de gestelde vraag en het doel van dataverzameling (bijvoorbeeld onderzoek of klaslokaal) zullen steekproefgrootte en verzameling van andere eigenschappen verschillen.
Om de fundamentele componenten van de fysiologie te illustreren die in dit protocol worden opgehelderd (inductie van chill coma, stappen van herstel, rol van omgevingsomstandigheden), kan een klasinstructeur twee verschillende soorten of morphs van één soort kiezen. Als de focale individuen slechts in één belangrijke eigenschap verschillen (bijv. kleur), zal een kleinere steekproefgrootte nodig zijn en kunnen studenten de relatie van die eigenschap en organismefysiologie nauwkeurig bestuderen. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in ecologische fysiologie kunnen hun experimentele gegevens gebruiken om complexe ecologische en evolutionaire vragen te verkennen. Onderzoekers moeten er zeker van zijn dat ze zorgvuldig focale insecten kiezen die hun vragen direct beantwoorden (bijvoorbeeld op basis van levensfase, leeftijd, geslacht, locatie) en, op basis van het aantal betrokken variabelen, de juiste steekproefgrootte bepalen. De steekproefgrootten voor complexe modellen zijn groter dan hierboven beschreven.
Tijdens het verzamelen van gedragsherstelgegevens is het belangrijk dat de kooi boven de grond rust, omdat de waarnemer op de bodem van de kooi moet kunnen tikken om herstelgedrag op te wekken. Dit zorgt ervoor dat het organisme reageert (staat, vliegt) zodra het fysiologisch in staat is om dit te doen, en het terminale herstelgedrag (vlucht) wordt gedocumenteerd. Het registreren van omgevingsomstandigheden tijdens het herstel van koude schokken is een integraal onderdeel van de studie van thermische fysiologie, omdat dit protocol is ontworpen om de rol van de omgeving in de organismefysiologie te bestuderen en te ontwarren. Dataloggers (zie de materialentabel)zijn nuttig om gestandaardiseerde metingen van relevante omstandigheden (bijv. temperatuur, licht en gelijkmatige vochtigheid) vast te leggen. Als deze tools echter niet beschikbaar zijn, kunnen relevante omstandigheden op andere manieren worden gemeten, zoals met een digitale thermometer of door de variabele omgevingsomstandigheden te vereenvoudigen en verschillende omgevingen zoals schaduw en zon te gebruiken. Dit protocol geeft de onderzoeker opties om de omstandigheden tijdens koude shock recovery te meten op basis van het doel en de omvang van het onderzoek.
Hoewel deze methode kan worden aangepast aan specifieke taxonomische groepen, wordt aanbevolen om grote, voluminante insecten te gebruiken. Vliegende insecten die hun vermogen om zelfstandig te vliegen herwinnen, kunnen worden beschouwd als een volledig herstel. De methode, zoals beschreven, werd met succes gebruikt op vlinders in de tropen en subtropen. Op basis van de thermische trends van een bepaald gebied (d.w.z. het temperatuurbereik op een locatie die zal variëren, waardoor de verwachtingen worden beïnvloed op basis van hoogte, breedtegraad, luifelbedekking), kan een organisme meer of minder dan een uur in een ijswaterbad nodig hebben om in een koude coma te komen. De grootte van het organisme kan ook van invloed zijn op de tijd die nodig is om in een koele coma te komen. Het is belangrijk om de tijd van koude blootstelling te vinden die nodig is om een koude coma te induceren (niet bewegen), maar niet om focale soorten te doden. De tijd die nodig is om een chill coma te induceren, hangt af van de grootte, locatie en natuurlijke geschiedenis / gedrag van de individuen. Op basis van de resultaten van het hierin beschreven koudeschokexperiment en met behulp van kennis van de ecologie van de focale insecten, kiest u een tijdstip waarop de proef moet worden afgesloten als een bepaald individu niet volledig herstelt.
Op basis van de specifieke vragen van de onderzoeker kan deze methode zowel in het veld als in het laboratorium worden gebruikt om zowel natuurlijke omgevingsvariatie als controle voor belangrijke variabelen mogelijk te maken. Deze test is eenvoudig en goedkoop en helpt bij het opvullen van bestaande hiaten op het gebied van thermische fysiologie. Het gemak van dit protocol maakt het toegankelijk om te gebruiken voor een breed scala aan taxa, waardoor het veld wordt geopend voor meer dan laboratoriumvriendelijke organismen. De nieuwigheid van het uitvoeren van een gestandaardiseerde maar omgevingsthermische test vult de kloof tussen laboratorium- en veldresultaten22. Door gebruik te maken van omgevingsomstandigheden voor het herstel van organismen zullen onderzoekers de rol van omgevings – en soortfactoren in de fysiologie kunnen verdelen14,22. Ten slotte kan dit protocol vanwege de lage kosten en het gebrek aan benodigde materialen worden gebruikt op afgelegen locaties in het veld met weinig apparatuur – ideaal voor veel veldbiologen – evenals in klaslokalen om jonge studenten een praktische leerervaring te bieden.
The authors have nothing to disclose.
Met dank aan Jaret Daniels, Isabella Plummer, Brett Scheffers en Dan Hahn voor input over het protocol zoals het voor het eerst werd ontwikkeld. Extra dank aan Jaime Haggard, Sebastián Durán en Indiana Cristóbal Róis-Málaver voor het implementeren van verschillende iteraties van dit protocol en voor input op belangrijke componenten. Ook dank aan een anonieme recensent voor feedback op het manuscript als geheel. De steun werd verleend door het McGuire Center for Lepidoptera and Biodiversity’s publication fund, het College of Agricultural and Life Sciences, School of Natural Resources and Environment en wildlife ecology and conservation department van UF.
24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage | Bioquip | 1466PB | Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments. |
Cooler | Any | NA | |
Glassine envelopes | Bioquip | 1130B | |
HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger | Onset | UA-002-08 | If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information. |
HOBO Optic USB Base Station | Onset | Base-U-1 | |
Ice water | NA | NA | |
Insects (focal taxa) | NA | Any | Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location) |
PVC T-joint | Any | Any | |
Sealable plastic bag | Any | NA | |
Stopwatch/timer | Any | NA | |
Weight | Any | NA | Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal. |