신경 퇴행성 질환은 dysregulated 마이크로글리아 기능과 관련이 있습니다. 이 문서는 iPSC-대식세포에 의한 신경 모세포종 세포의 phagocytosis의 체외 분석방법을 설명합니다. 정량현미경 판독은 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰 과 고정 세포 고함량 화상 진찰을 위해 기술됩니다.
Microglia는 파킨슨 병과 알츠하이머 병을 포함한 여러 신경 퇴행성 질환에서 신경 면역 반응을 조율합니다. Microglia는 phagocytosis의 전문적인 양식인 efferocytosis의 과정을 통해 죽고 죽어가는 뉴런을 정리합니다. phagocytosis 기능은 microglia에 영향을 미치는 환경 또는 유전 위험 요소에 의해 중단될 수 있습니다. 이 논문은 식세포화물에 대한 pH 민감성 염료로 표지된 인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)를 사용하여 마이크로글리아의 유도된 만능 줄기 세포(iPSC) 모델에서 미세글리아 에페로세포증을 연구하기 위한 신속하고 간단한 체외 현미경 프로토콜을 제시한다. 절차는 파고 세포에 의해 “먹는 나”신호로 인식 표면 인산화를 표시 죽은 신경 모세포종 세포의 높은 수율 결과. 상기 96웰 플레이트 분석법은 라이브 셀 타임랩스 이미징에 적합하거나, 플레이트는 고함량 현미경 검사법에 의해 추가 처리 및 정량화되기 전에 성공적으로 고정될 수 있다. 고정 세포 고함량 현미경 검사는 소분자 억제제의 스크리닝을 위해 분석법을 확장하거나 유전 적 변이체 iPSC 라인의 phagocytic 기능을 평가할 수 있게 한다. 이 분석체는 iPSC-대식세포에 의한 전체 죽은 신경모세포종의 식증증을 연구하기 위해 개발되었지만, 분석체는 시냅토좀 및 골린 및 기타 식세포 유형과 같은 신경 퇴행성 질환과 관련된 다른 화물에 쉽게 적응할 수 있다.
Microglia는 뇌 조직 거주자 대식세포이며, 그들의 기능은 면역 감시를 포함, 상해 / 감염에 염증 반응을 조정, 시냅스 리모델링, 죽은 세포의 phagocytosis, myelin, 단백질 집계, 및 병원균. Phagocytosis는 microglia가 표면 수용체와 화물을 인식하고 다음화물의 저하를 위해 리소좀과 융합 phagosome로 개체를 삼키기 위해 자신의 세포 골격을 재구성하는 과정입니다. 건강한 microglia phagocytose 세포 세포는 괴사1되기전에 그들을 제거하는 것을. 세포 세포의 식세포는 또한 efferocytosis로 알려져 있으며, 죽어가는 세포2에의하여 인산다이들세린 “eat-me” 신호의 표시를 요구한다. 수많은 마이크로글리아 수용체는 TIM-4, BAI1, Stabilin-2 및 TREM2를 포함하여 인산염에 직접 결합합니다. Microglial TAM 수용체(예를 들어, MERTK) 및 인테그린은 각각 액세서리 단백질 GAS6 또는 MFG-E8을 사용하여 인파디델세린에 간접적으로 결합한다. 다른 “eat-me” 신호는 죽어가는 세포의 인식에 필요할 수 있습니다., 이들은 글리코실화 또는 표면 단백질의 전하에 변화를 포함; 세포 내 단백질 ICAM3, 칼레티쿨린, 세포 표면의 부속제-I의 발현; 산화 LDL; 또는 마이크로글리아 생산에 의한 세포 세포의 코팅은 C1q1,2를상량한다.
파킨슨병, 알츠하이머병, 전두엽 치매, 근위축성 측삭 경화증 을 포함한 신경퇴행성 질환은 죽은 세포, 골린 단편, 단백질 응집체 와 같은 뇌 폐기물의 축적을 포함하여 마이크로글리아 기능에 대한 손상과 관련이 있으며, 이러한자극3에대한 과장된 염증 반응. 식세포증은 신경 퇴행성 질환에서 손상될 수 있으며 노화, 염증 또는 특정 유전적 위험 변이체4,5의조합으로 인해 병리학에 기여할 수 있다. 한편, 마이크로글리아가 부적절한 식세포증이 가능한 뉴런 또는 시냅스6,7,8을할 수 있다는 신경퇴행성 질환의 동물 모델도 있다. 이 메커니즘은 마이크로글리아질 식세포 수용체 TREM2 또는 GPR56에 의해 직접적으로 감지되거나 간접적으로 용해 성 체형 C1q 코팅C1q코팅에 의해 감지되는 손상된 뉴라이트의 인산화제린 디스플레이에 의해 선동될 가능성이 높으며, 이는 CR3-phagois1, CR3-phagois1, 90-phagoistoted10에이르는 코피타이들벨세린 농축 멤브레인을 코팅하는 용해성 상류체에 의해 간접적으로 감지된다.
식세포 기능의 시험관 내 소사, 예를 들어, 마이크로글리아에서 유전 적 위험 변이체의 현상적 영향을 평가하기 위해, 라텍스 구슬4와같은 비생리적 화물을 사용하여 자주 수행된다. 형광으로 표지된 박테리아와 zymosan은 생리적이지만 신경 퇴행성 질환과 관련이 없는 사용됩니다. 비생리적 생리성 화물은 식세포 침몰의 기본 기계에서 결함을 감지하는 데 사용할 수 있지만 세포 신경의 phagocytosis에서 첫 번째 “인식”단계를 정확하게 모델링하지 못합니다. 화물의 크기, 모양, 강성 및 유형은 또한 활성화된 세포내 신호 경로를 지시하여 microglia 활성화 상태의 다른 결과를 초래합니다. 예를 들어, 대장균 균은 인간 세포와 달리 작고 뻣뻣하며, 표면에 있는 리포폴리사카라이드는 식세포증 및 프로 염증 신호 경로를 활성화하는 톨-유사 수용체 4(TLR4)에 의해 인식된다2,12.
신경 퇴행성 질환 연구의 맥락에서, 더 관련 phagocytic 화물 포유류 플라즈마 막에 인산화 체린 디스플레이 있을 것 이다, 이상적으로 인간과 신경 것, microglia 발생할 가능성이 신호를 포함. 이러한 식세포프로토콜의 경우, 인간 신경모세포종 세포주 SH-SY5Y는 배양하기 쉬운 뉴런 모델로 선택되었다. 영구 표면 인산화제린 디스플레이는 파라포름알데히드에 의해 인위적으로 유도되었으며, 이는 이전에 혈소판13의포스파디들세린 디스플레이를 유발하는 것으로 나타났다. microglia 세포 모델 인간 iPSC-대식세포가 사용되어 인간 마이크로글리아의 온토게니 및 전사 프로파일을 모방하고, phagocytically유능한 14,15,16,17. iPSC-대식세포는 가장 정통 적인 microglia 모델 사용, 예를 들어, 그들은 마이크로 글리아 형태를 모방 하지 않습니다;; 그러나, 원할 경우 microglia의 보다 정통 단일문화 iPSC 모델로 대체할 수있다. 인간 iPSC 모델은 인간 대 마우스 신경퇴행성 질환 조직조직(18)에서관찰된 마이크로글리아 전사 모듈의 제한된 중첩에 대한 우려로 인해 신경 변성을 연구하기 위한 1차 설치류 마이크로글리아보다 바람직하다. 죽은 SH-SY5Ys는 중성 pH에서 약하게 형광하고 phagocytosis 후 iPSC 대식세포의 phagolysosomes 안쪽에 더 강하게 형광하는 산에 민감한 염료로 얼룩져 있습니다. 산에 민감한 염료를 사용하면 식세포 이벤트를 감지하는 정확도를 향상시키고, 라이브 및 고정 대식세포19의다양한 판독을 위한 다기능성을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 식세포증의 라이브 셀 타임랩스 이미징과 식세포증에 대한 고정 된 고함량 이미징 분석, 판독 전에 동일한 세포 준비 단계를 모두 간략하게 설명합니다(그림 1).
그림 1: 방법론의 회로도. cagocytosis 분석의 개요, 여기서 SH-SY5Ys의 준비 및 iPSC-대식세포의 염색은 병렬로 수행되고, 다음 SH-SY5Ys는 iPSC-대식세포에 배관된다. 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰은 즉시 능력을 발휘하거나, 세포는 필요한 기간 동안 37°C/5% CO2에서 배양되고 고함량 현미경 검사를 수행하기 전에 고정된다. PFA: 파라포멀데히드, HBM: 페놀 레드 프리 HEPES 버퍼링 미디어, pHr: pH-민감한 적색 형광염염수 STP 에스테르 솔루션, PRFMM: 페놀 레드 프리 대식세포 미디어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Microglia는 세포 세포 신경세포의 phagocytosis를 포함하여 신경 퇴행성 질병의 개시 그리고 진행에 영향을 미치는 중요한 기능을 가지고 있습니다. 손상된 microglial phagocytosis 및 시 냅 스의 부적 절 교 감 증 둘 다 신경 퇴행 성 질환과 관련 된, 기본 메커니즘 및 인과 잘 이해 되지 않지만4,23. 이 논문은 iPSC-대식세포에 의한 세포 세포 의 식세포증을 측정하는 식세포 분석법을 간략하게 설명하며, 라이브 셀 타임랩스 이미징 판독또는 고정 셀 고함량 현미경 검사법 또는 단일 분석기의 조합으로 구성된다. 이 다재다능함은 분석이 몇 가지 우물에서 시간이 지남에 따라 개별 phagocytic 이벤트를 연구하는 데 사용되거나 여러 조건이나 치료법으로 고함량 스크리닝에 사용될 수 있음을 의미합니다. 고함량 분석이 단일 타임포인트에 고정되므로 여러 분석 플레이트를 동시에 준비할 수 있습니다. 고함량 분석은 질병 관련 유전 이체로 대식세포/마이크로글리아를 특성화하거나 식세포증의 변화에 대한 작은 분자 억제제를 선별하는 잠재적 인 유틸리티를 가지고 있습니다. 분석은 또한 쉽게 다른 microglia 모델의 phagocytosis를 공부하기 위하여 적응될 수 있습니다, 또는 잠재적으로 성상 세포. 식증 분석은 잠재적으로 살아있는 세포 이미징 얼룩, 예를 들어, 미토콘드리아, 칼슘, 또는 ROS 지표로 멀티플렉스화될 수 있으며, 단백질에 대한 고정 후 면역형광 염색을 수행할 수 있다. 세포 세포 세포를 활용하는 기존의 식세포 분석법에 비해, 이 프로토콜이 부여하는 주요 장점은 phagocytic 화물의 제조가 비교적 간단하고 빠르며 균일 한 제품으로 초래한다는 것입니다. 다른 아세약은 2시간 25분, 오카다산용 2시간 25분, 4-16h26,27,28,29 또는 UV-조사용 S-니트로소-L-시스테인을 가진 뉴런 또는 SH-SY5Ys의 세포 나 SH-SY5Ys의 세포멸을 유도하고, 24h30의세포에서 다른 세포에 발생할 수 있다. 더욱이, 살아있는 세포 화상 진찰 및 고함량 화상 진찰 읽기는 저자가 인식하는 한, 이전에 설명되지 않았습니다. 파포름알데히드 고정을 사용하여 phagocytic 화물을 준비하는 주요 제한은 세포가 더 작은 크기로 인해 세포가 세포로 분할되는 것을 막기 때문에 세포가 세포가 세포가 세포로 분할되는 것을 완전히 재구성하지 않는다는 것입니다. 그것은 고정이 phagocytes를 유치하는 표적 세포에서 뉴클레오티드 “나를 찾아”신호 (예를 들어, ATP, UDP)의 분비에 어떤 효과 고정이 있는지 알 수 없습니다. 세포 세포와 유사하게, 고정된 SH-SY5Ys는 요오드제를 프로피듐에 대한 일부 멤브레인 투과성을 나타낸다. 멤브레인 투과성은 “나를 찾아”신호의 방출과 관련이 있습니다; 그러나, 이것은 고정된 SH-SY5Ys에서 공부되지 않았으며, 뉴클레오티드가 너무 빨리 방출되는 경우에, SH-SY5Ys가 iPSC-대식세포에 추가되기 전에 멀리 세척될 것이다.
프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 pH 에스테르가 있는 죽은 SH-SY5Y를 pH 에스테르로 염색하는 것입니다. 이 염료는 죽은 SH-SY5Ys의 표면에 무료 기본 아민과 신속하고 공유적으로 반응한다. 염색 지속 시간을 최적화할 필요가 없습니다. 그러나 라벨을 붙이기 전에 염료를 처리하는 데 주의를 기울여야 합니다. 라벨링 반응은 무료 아민을 포함하는 버퍼에서 수행되어서는 안 됩니다. 더욱이, DMSO 재고가 감기 수성 완충또는 높은 최종 농도로 희석될 경우 강수량이 발생할 위험이 있다. 침전물은 현미경의 밑에 조밀한 어두운 객체로 나타납니다. 또한, pH 에 민감한 염료 용액은 일반 플라스틱 원심분리기 튜브에 달라 붙어 천천히 하스포합니다. 따라서 라벨링 단계에는 바인딩이 낮은 튜브가 권장됩니다. pH 에 민감한 염료를 사용하면 영구적으로 형광 염료 대신 에광된 입자의 식별을 돕고 플라즈마 멤브레인을 접대하는 입자에 대해 도움을 줄 수 있습니다. 중립 pH에는 약간의 형광이 있기 때문에, 식세포 화물및 iPSC-대식세포의 밀도는 정확한 세분화를 위해 충분히 낮게 유지되어야 하지만, 수많은 식세포 이벤트가 포착될 만큼 충분히 높습니다. 고함량 현미경 검사는 우물에서 화물의 중간 밀도(iPSC-대식세포당 2SH-SY5Ys 이상)로 식증을 정확하게 식별할 수 있었습니다. 반대로, 깊은 적색 스펙트럼에서 현미경의 민감도가 약하기 때문에, 살아있는 세포 시간 경과 이미징 데이터에서 iPSC-대식세포의 세분화는 자신감이 부족하고 거짓 긍정의 가능성을 줄이기 위해 화물의 매우 낮은 밀도를 사용해야 했습니다 (2 개의 iPSC-대식세포마다 1 SH-SY5Y). 적절한 세분화 및 화물 밀도의 검증은 처리되지 않은 및 사이토샬라신 D 처리 우물 사이의 비교와 함께 수행되어야합니다. 잘 최적화된 분석에서, cytochalasin D는 처리되지 않은 견본에 비해 세포 당 반점의 평균 수를 90% 감소시켜야 합니다.
프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 iPSC-대식세포 염색으로, 이는 모든 외부 SH-SY5Y가 개구부에서 제외되도록 세포를 이미지 분석에서 식별하고 분할할 수 있도록 하는 것입니다. 권장염료는 세포 감이 있으며 세포질 내불용 형광 제품으로 변환되어 고칠 수 있으며 독성이 없습니다 (재료 표참조). 염색 단계는 고함량 이미징 phagocytosis 분석과 iPSC-대식세포의 사용에 최적화되었으며, 다른 세포 유형을 사용하는 경우 다시 최적화되어야 한다고 제안합니다. 세포 염색의 지속 기간은 세포 내의 불용성 형광 제품의 증착을 향상시키기 위하여 증가할 수 있습니다. 염료 농도가 최적화되면 유기 용매 차량의 독성 수준을 피하기 위해주의를 기울여야합니다.
분석의 성공에 대한 세 번째 중요한 요소는 데이터 분석입니다. 제공된 분석 파이프라인은 얼룩 강도 또는 세포 형태에 대한 차이로 인해 파이프라인의 세분화 효과를 기록할 수 있기 때문에 규범이 아닌 지침이 될 수 있습니다. 따라서 적절한 양수 및 음수 컨트롤에 대한 파이프라인 테스트와 최적화해야 하는 매개 변수를 프로토콜 텍스트에 표시하여 일부 최적화가 필요합니다. 부정적인 대조군은 SH-SY5Ys를 첨가하기 전에 iPSC-대식세포가 세포증 D와 같은 강력한 식세포 억제제로 미리 처리되는 조건을 포함해야 한다. 또 다른 가능한 부정적인 제어는 분석의 끝에 iPSC-대식세포의 이전에 처리되지 않은 우물에 SH-SY5Ys를 첨가하고, 고정하기 10 분 전에, 이는 화물의 일부 침전을 허용하지만 phagocytosis의 감사 수량에 너무 짧다. phagocytosis 이벤트는 깊은 적색 형광 채널을 사용하여 소프트웨어 알고리즘에 의해 정의된 iPSC-대식세포의 테두리 내의 적색 형광 개체로 정의됩니다. 세포의 세분화가 불량한경우(도 2),iPSC-대식세포에 근접한 많은 비-식세포 SH-SY5Y가 분석, 즉 거짓 긍정에 잘못 포함될 수 있다. 좋은 세분화를 달성하는 가장 중요한 요소는 iPSC-대식세포의 엄격한 묘사입니다. 두 해석모두에 대한 세분화가 자동화되므로 모든 셀에 대해 완벽한 세분화를 얻을 수 없습니다. 그러나 몇 가지 테스트 이미지를 참조로 사용하여 세분화를 보다 최적입니다. 사이토찰라신 D 제어는 이 조건에서 검출된 많은 수의 phagocytic 이벤트가 세분화가 최적이아님을 나타내기 때문에 최적의 세분화를 평가하는 데 중요합니다. 데이터 분석 파이프라인의 최적화는 세포당 phagocytic 이벤트의 수가 세포별 80%-90% 더 낮을 때까지 이상적으로 반복되어야 하며, 아토찰라신 D 조건에서는 억제제가 없다.
발생 가능성이 가장 높은 phagocytosis 분석의 문제점은 다음과 같습니다: (1) 양성 대조군에서 약한 pH 에 민감한 형광, (2) 분석의 끝에 대식세포의 희소 또는 고르지 않은 분포, 또는 (3) 비 phagocytosed SH-SY5Ys에서 분석에서 거짓 긍정의 높은 숫자. 약한 pH 에 민감한 형광의 문제 해결은 먼저 SH-SY5Ys의 염색이 강한 마젠타 색을 가진 세포 펠릿귀가 초래되었다는 것을 확인해야합니다. 색상이 약한 경우, 신선한 염료 재고가 사용되는지 확인하고, 라벨링 버퍼가 아민이 없는지 확인하고, 염색하기 전에 SH-SY5Y에 추가 세척을 추가하고, 정확한 수의 SH-SY5Y가 염색되었는지 확인하고, 염료 침전량이 증거가 없는지 확인하고, 염료 침전물의 농도를 최적화합니다. SH-SY5Y가 강하게 염색되면 분석판에 첨가된 농도가 정확한지 확인하고 iPSC-대식세포가 건강하고 너무 오래되지 않았는지 확인하십시오. 두 번째 유형의 문제인 고르지 않은 대식세포 분포는 파이펫 팅 중 세포의 손실로 인해 발생할 수 있으며 좁은 보어 팁을 피하면서 세포에서 경험하는 파이펫팅 력을 줄이기 위한 조치를 취해야 합니다. 문제가 남아 있으면 iPSC-대식세포를 세포 에 대한 무의미한 염료로 적재하는 잠복기 시간을 줄입니다. 세 번째 문제는 분석에서 비식세포 입자를 잘못 포함하는 것과 관련하여 분석 파이프라인의 최적화가 더 필요하다는 것을 나타냅니다. 문제 해결은 먼저 셀 세분화 및 소프트웨어가 인접 한 개체를 포함 하는지 여부에 초점을 맞추어야 합니다. 조정할 수 있는 특정 매개 변수는 관련 단계 이하의 노트에서 제안된다(라이브 셀 타임랩스 분석을 위한 단계 6.1.11-6.15 및 고함량 분석을 위한 단계 6.2.4-6.2.8). 세포 세분화를 더 개선할 수 없는 경우, 고함량 분석은 부적절하게 분할된 iPSC-대식세포를 배제하는 추가 단계(단계 6.2.8)를 가한다. 더욱이, iPSC-대식세포 내에서 pH 민감형의 허용된 반점을 걸러내는 모듈을 최적화하여 허용된 개체의 임계값 강도를 증가시켜 비-phagocytosed SH-SY5Ys를 배제하는 데 도움이 될 것입니다(라이브 셀 타임랩스 분석을 위한 단계 6.1.17, 및 높은 함량 분석을 위한 단계 6.2.11).
우리는 각각 장점과 한계가 있는 phagocytosis 분석에 대한 현미경 판독의 두 가지 유형을 개발했습니다. 라이브 셀 타임랩스 이미징은 phagocytosis 운동학에 대한 추가 정보를 제공하는 장점이 있으며 고콘텐츠 이미징 플랫폼보다 더 널리 사용할 수 있습니다. 권장된 오픈 소스 소프트웨어는 현미경 소스에 불가지론적이며 라이브 셀 타임 랩스 기능의 유무에 관계없이 양질의 형광 현미경과 함께 사용할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징의 주요 제한은 제한된 감도와 광학으로 iPSC-대식세포의 좋은 세분화를 감지하고 수행하는 것이 더 어려워집니다. 이 제한은 iPSC-대식세포 염색의 기간을 증가시키거나, 사용 가능한 경우에 더 민감한 현미경으로 전환하여 완화될 수 있었습니다. 고함량 이미징 식세포 분석은 고함량 이미징 시스템을 사용할 수 있는 경우 권장 판독입니다. 고콘텐츠 이미징 시스템은 더 높은 처리량과 보다 안정적인 데이터를 가능하게 하여 이 분석이 스크리닝에 사용될 수 있게 해주며, 이 분석은 “셀당 반점 수” 출력20에대해 ≥0.7의 강력한 Z’가 예상될 것으로 예상됩니다. 라이브 셀 타임랩스 방법에 비해, 고함량 현미경 판독기는 더 높은 감도, 높은 수준의 자동화 및 속도, 더 많은 우물 및 이미징 필드를 처리할 수 있으며 고해상도 공초점 이미지가 생성됩니다. 세포 세분화는 좋은 이미지로 더 효과적이며, 세분화는 고불규칙한 모양의 세포에 적합한 더 많은 세포 세분화 방법을 제공하는 고함량 이미징 분석 소프트웨어에 의해 추가적으로 지원된다. 고함량 이미징 분석 소프트웨어는 또한 phagocytosis의 더 많은 매개 변수를 계산, 오픈 소스 소프트웨어에 비해, 이러한 phagocytic 세포의 백분율등. 고함량 phagocytosis 분석의 주요 한계는 이미징 시스템 및 분석 소프트웨어의 비용과 접근성 중 하나입니다.
결론적으로, 이 논문에 제시된 정량적 phagocytosis 분석체는 체외에서 죽은 뉴런의 microglia phagocytosis를 모델링하기 위한 유용한 도구입니다. 마이크로글리아는 iPSC-대식세포에 의해 모델링되고 죽은 뉴런은 파라포름알데히드 고정 SH-SY5Ys에 의해 모델링됩니다. 비록 가장 본격적인 microglia 및 죽은/apoptotic 뉴런 모델 게시, 이들은 쉽게 준비 하 고 확장. 분석 자체는 매우 다재다능하며 두 가지 유형의 이미징 판독이 상세하며, 다른 마이크로글리아/대식세포 단양 모델 또는 다른 세포 유형과 함께 사용하기 위해 적응할 가능성이 있습니다. 고함량 이미징 판독값은 정량적 데이터를 얻기에 유리하며, iPSC-대식세포에서 식세포증의 소분자 변조기 또는 스크린 유전적 변이체까지 확장할 수 있다. 그러나 고함량 이미징 시스템은 비용이 많이 들고 데이터 가중이기 때문에 필요한 경우 양질의 기존 형광 현미경으로 대체 될 수있는 라이브 셀 타임 랩스 현미경을 사용하여 프로토콜에 대체 된 대체 된 이미징 판독이 프로토콜에 포함되었습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 높은 함량현미경 검사법에 대한 도움을 준 발 밀러 박사와 소하이브 니자미 박사와 고함량 현미경에 대한 접근을 위한 다니엘 이브너 박사에게 감사드립니다. 또한, 저자는 분석 개발 조언에 대한 박사 엠마 미드, 부인 캐시 브라운 iPSC 지원을 감사드립니다. 이 작품은 알츠하이머 연구 영국 옥스포드 약물 발견 연구소에 의해 지원되었다 (ARUK ODDI, 보조금 참조 ARUK-2020DDI-OX), 옥스포드 마틴 학교 LC0910-004에서 제임스 마틴 줄기 세포 시설 옥스포드에 추가 지원 (S.A.C.); 파킨슨 병 영국에서 기념물 신뢰 발견 상 (J-1403); MRC 치매 플랫폼 영국 줄기 세포 네트워크 자본 장비 MC_EX_MR/ N50192X/1, 파트너십 MR/N013255/1, 모멘텀 MC_PC_16034 어워드.
15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 352096 | For centrifugation of cells |
2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes | |||
2-mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | Component of Factory media |
4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | J61899 | For fixation of cells |
6-well plate, tissue culture treated | |||
AggreWell-800 24-well plate | STEMCELL Technologies | 34815 | Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies |
Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit | Abcam | ab14085 | Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide. |
Automated cell counter | |||
Benchtop centrifuge | |||
Benchtop microcentrifuge | |||
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay |
CellProfiler software | Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0. | ||
CellTracker Deep Red dye | Thermo Fisher | C34565 | Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. |
Class 2 laminar air flow safety cabinet | |||
CO2 gas bottle | Accessory for EVOS FL Auto | ||
CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2 | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis System | Perkin Elmer | Columbus | Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments. |
Cytochalasin D | Cayman | 11330 | Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM. |
DMEM/F12 | Gibco | 11320074 | Component of SH-SY5Y media |
DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for CellTracker and pHrodo dyes |
EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher | AMF4300 | Live-cell time-lapse imaging microscope |
EVOS Light Cube CY5 | Thermo Fisher | AMEP4656 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Light Cube DAPI | Thermo Fisher | AMEP4650 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Light Cube RFP | Thermo Fisher | AMEP4652 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Onstage Incubator | Thermo Fisher | AMC1000 | Accessory for EVOS FL Auto |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | Component of SH-SY5Y media |
Flow cytometer | |||
Flow cytometry analysis software | |||
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413302 | hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-038 | Component of both Factory and Macrophage media |
HBSS | Lonza | BE 10-547F | Hank’s balanced salt solution for washing steps |
Human recombinant BMP4 | Gibco | PHC9534 | Component of Embryoid Body media |
Human recombinant IL-3 | Gibco | PHC0033 | Component of both Factory and Macrophage media |
Human recombinant SCF | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Component of Embryoid Body media |
Human recombinant VEGF | Gibco | PHC9394 | Component of Embryoid Body media |
Live Cell Imaging Solution | Thermo Fisher | A14291DJ | Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys |
Low protein binding 2 mL tubes | Eppendorf | 30108.132 | For staining SH-SY5Ys |
M-CSF | Thermo Fisher | PHC9501 | Component of both Factory and Macrophage media |
mTeSR1 Medium | STEMCELL Technologies | 85850 | iPSC media |
Multichannel 20-200 uL pipette | For liquid handling of 96-well plate | ||
NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher | R37605 | Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media. |
Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | HH14000000 | High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9. |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media |
pHrodo iFL Red STP-Ester | Thermo Fisher | P36011 | pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. |
Serological pipette filler | |||
T175 flask, tissue culture treated | Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories" | ||
T75 flask | Vessel for SH-SY5Y culture | ||
Transparent plate sealers | Greiner Bio-One | 676001 | For assay plate storage and transportation |
TrypLE Express (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat. |
Water bath, set to 37°C | |||
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red | Lonza | BE04-418F | Component of Factory and Macrophage media |
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red | Lonza | 04-744Q | Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors |