Imaging cellulare vivo ROS durante lo sviluppo neuronale

Summary

Questo protocollo descrive l’uso di un perossido di idrogeno geneticamente codificato (H₂O₂₎biosensore nei neuroni e nelle larve di zebrafish coltivati per valutare i ruoli fisiologici di segnalazione di H₂O_{2 durante} lo sviluppo del sistema nervoso. Può essere applicato a diversi tipi di cellule e modificato con trattamenti sperimentali per studiare specie reattive dell’ossigeno (ROS) in generale sviluppo.

Abstract

Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono molecole di segnalazione ben consolidate, che sono importanti nello sviluppo normale, nell’omeostasi e nella fisiologia. Tra i diversi ROS, il perossido di idrogeno (H₂O₂) è meglio caratterizzato rispetto ai ruoli nella segnalazione cellulare. H₂O₂ è stato implicato durante lo sviluppo in diverse specie. Ad esempio, un aumento transitorio di H₂O_{2 è} stato rilevato negli embrioni di zebrafish durante i primi giorni successivi alla fecondazione. Inoltre, l’esaurimento di un’importante sorgente cellulare H₂O_2, la NADPH ossidasi (NOX), compromette lo sviluppo del sistema nervoso come la differenziazione, la crescita assonale e la guida delle cellule gangliari retiniche (GRGC) sia in vivo che in vitro. Qui descriviamo un metodo per l’imaging dei livelli intracellulari H₂O₂ nei neuroni zebrafish coltivati e nelle larve intere durante lo sviluppo utilizzando il biosensore specifico di H₂O₂geneticamente codificato, roGFP2-Orp1. Questa sonda può essere espressa transitoriamente o stabilmente nelle larve di zebrafish. Inoltre, la lettura ratiometrica riduce la probabilità di rilevare artefatti dovuti all’espressione genica differenziale o agli effetti di volume. In primo luogo, dimostriamo come isolare e coltura le RGC derivate da embrioni di zebrafish che esprimono transitoriamente roGFP2-Orp1. Quindi, usiamo larve intere per monitorare i livelli di H₂O₂ a livello di tessuto. Il sensore è stato convalidato con l’aggiunta di H₂O₂. Inoltre, questa metodologia potrebbe essere utilizzata per misurare i livelli di H₂O₂ in specifici tipi cellulari e tessuti generando animali transgenici con espressione biosensore specifica del tessuto. Poiché i pesci zebra facilitano le manipolazioni genetiche e dello sviluppo, l’approccio dimostrato qui potrebbe servire come pipeline per testare il ruolo di H₂O_{2 durante} lo sviluppo embrionale neuronale e generale nei vertebrati.

Introduction

La segnalazione reattiva delle specie di ossigeno (ROS) regola lo sviluppo e il funzionamento del sistema^{nervoso 1}. Un’importante fonte cellulare di ROS sono le ossidasi NADPH (NOX), che sono proteine transmembrana che generano superossido e perossido di idrogeno (H₂O₂)². Gli enzimi NOX si trovano in tutto il sistema nervoso centrale (SNC) e il ROS derivato dal NOX contribuisce allo sviluppo^{neuronale 3,4,5,6}. Il mantenimento e la differenziazione delle cellule staminali neurali, stabilendo polarità neuronale, crescita della neurite e plasticità sinaptica hanno dimostrato di richiedere livelli adeguati di ROS^7,8,9,10,11. D’altra parte, la produzione incontrollata di ROS da parte dei NOX contribuisce a disturbi neurodegenerativi tra cui il morbo di Alzheimer, la sclerosi multipla e la lesione cerebrale^{traumatica 12,13,14}. Pertanto, la produzione di ROS fisiologicamente rilevante è fondamentale per mantenere condizioni sane.

Lo sviluppo di biosensori geneticamente codificati ha facilitato notevolmente il rilevamento del ROS cellulare. Un importante vantaggio dei biosensori geneticamente codificati è l’aumento della risoluzione temporale e spaziale del segnale ROS, poiché questi sensori possono essere specificamente mirati a posizioni distinte. La GFP sensibile ai redox (roGFP) è un tipo di biosensori ROS di questo tipo. La variante roGFP2-Orp1 rileva specificamente H₂O_{2 attraverso} il suo dominio Orp1, che è una proteina della famiglia glutatione perossiredossina dal^{lievito 15,16}. L’ossidazione della proteina Orp1 viene trasferita al roGFP2 per alterarne la conformazione (Figura 1A). La sonda presenta due picchi di eccitazione vicino a 405 nm e 480 nm e un singolo picco di emissione a 515 nm. All’ossidazione, l’intensità di fluorescenza intorno ai picchi di eccitazione cambia: mentre aumenta l’eccitazione di 405 nm, diminuisce l’eccitazione di 480 nm. Pertanto, roGFP2-Orp1 è un biosensore ratiometrico, e i livelli H₂O_{2 sono}rilevati dal rapporto di intensità di fluorescenza eccitate a due diverse lunghezze d’onda (Figura 1B). Nel complesso, roGFP2-Orp1 è uno strumento versatile per l’imaging ROS che può essere utilizzato in modo efficiente in vivo.

Figura 1: Rappresentazione schematica e spettri di eccitazione del trasferimento ossidante roGFP2-Orp1. (A) avviene tra Orp1 e roGFP2 in risposta a H₂O_2,portando a cambiamenti conformazionali nel roGFP2. (B) Gli spettri di eccitazione del roGFP2-Orp1 presentano due picchi di eccitazione a 405 nm e 480 nm e un picco di emissione singola a 515 nm. All’ossidazione di H₂O₂, l’eccitazione di 405 nm aumenta mentre l’eccitazione di 480 nm diminuisce. Ciò si traduce in una lettura ratiometrica per la presenza di H₂O_2. La cifra è stata modificata da Bilan e Belousov (2017)¹⁶ e Morgan et al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il sistema di modelli Danio rerio (zebrafish) presenta diversi vantaggi per l’applicazione di biosensori geneticamente codificati. La trasparenza ottica degli embrioni e delle larve consente l’imaging in vivo non invasivo. Sono in fase di sviluppo nuovi strumenti di imaging per ottenere una risoluzione più elevata e una penetrazione^{più profonda 17}. Inoltre, esistono strumenti consolidati per la manipolazione genetica (espressione ectopica di mRNA, transgenesi Tol2, ecc.) e l’editing del genoma (TALEN, CRISPR / Cas9, ecc.), che promuove la generazione di animali transgenici¹⁸. Man mano che gli embrioni di zebrafish si sviluppano al di fuori della madre, questo sistema consente ulteriormente un accesso e una manipolazione più facili degli embrioni. Ad esempio, le iniezioni a uno stadio e i trattamenti farmacologici possono essere facilmente eseguiti.

Qui, abbiamo usato il pesce zebra per esprimere transitoriamente il biosensore specifico H₂O₂roGFP2-Orp1 iniettando mRNA trascritto in vitro. Questi embrioni possono essere utilizzati sia per l’imaging in vitro di neuroni coltivati che per l’imaging in vivo ( Figura2). Descriviamo un protocollo per la sezionatura e la placcatura delle cellule gangliari retiniche (GRGC) da embrioni di zebrafish seguito dalla valutazione dei livelli di H₂O₂nei neuroni coltivati. Quindi, presentiamo un metodo per l’imaging in vivo di embrioni e larve che esprimono roGFP2-Orp1 usando la microscopia confocale. Questo approccio non solo consente di determinare i livelli fisiologici di H₂O_2,ma anche i potenziali cambiamenti che si verificano in diversi stadi o condizioni di sviluppo. Nel complesso, questo sistema fornisce un metodo affidabile per rilevare H₂O₂ in cellule vive e animali per studiare il ruolo di H₂O₂ nello sviluppo, nella salute e nelle malattie.

Figura 2. Schema dell’approccio sperimentale. In breve, dopo la raccolta dell’embrione, l’mRNA roGFP2-Orp1 viene iniettato nel tuorlo di embrioni zebrafish a una cellula. Gli embrioni in via di sviluppo possono essere utilizzati sia perl’imaging in vitro ( A ) che perl’imaging in vivo ( B ). (A) Gli embrioni positivi alla GFP vengono utilizzati per sezionare retine per la raccolta RGC a 34 hpf. Le RGC dissociate sono placcate su coverlips rivestite in PDL/laminina in supporti ZFCM (+). L’imaging del cono di crescita può essere condotto mentre le RGC estendono i loro assoni dopo 6-24 ore di placcatura. Le cellule possono essere sottoposte a diversi trattamenti per misurare i potenziali cambiamenti nei livelli H₂O_2. Qui, abbiamo misurato i_{livelli H 2}O₂nei coni di crescita delle GRGC (rosso). (B) Gli embrioni positivi alla GFP sono utilizzati per l’imaging in vivo. All’età desiderata, gli embrioni possono essere anestetizzati e montati su piatti di fondo in vetro da 35 mm per l’imaging confocale. Qui, gli embrioni sono montati ventralmente per l’imaging retinale. Schema mostra lo sviluppo retinale nel pesce zebra. Le GRGC formano lo strato cellulare ganglionale (GCL), che è lo strato più interno della retina. Gli assoni RGC si sviluppano nel nervo ottico per attraversare la linea mediana, formando chiasmo ottico. Quindi, gli assoni RGC crescono dorsalmente per fare sinapsi nel tectum ottico nel midbrain. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati eticamente dal Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), seguendo le linee guida NIH con il protocollo 2006002050 approvato il 24/07/2020. 1. Preparazione di soluzioni Supporti E2 (1x) Preparare soluzioni E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) e 500x E2C (100 mL) combinando tutti i componenti mostrati nella tabella 1. Soluzioni Autoclave E2A, E2B ed E2C. Conservare a 4 °C. Per 1 sup…

Representative Results

Le RGC zebrafish coltivate estendono gli assoni entro 1 d. Un’immagine rappresentativa del rapporto 405/480 del biosensore H2O2è illustrata nella figura 4A. Il corpo cellulare, l’assone e i coni di crescita sono chiaramente visibili nei singoli neuroni. Questi neuroni possono essere sottoposti a diversi trattamenti nel tempo per monitorare i cambiamentiH 2O2. In precedenza abbiamo scoperto che l’aggiunta di 100 μM H2O 2 ai supporti<sub…

Discussion

Ci sono diversi passaggi critici che necessitano di attenzione in tutto questo protocollo. Riteniamo che considerare questi punti migliorerà il flusso sperimentale. Per la coltura RGC primaria, la sterilità dello ZFCM(-) è molto importante, poiché questo supporto di coltura non contiene antibiotici e la contaminazione può verificarsi prima o durante l’imaging. Per evitarlo, si consiglia di preparare e utilizzare ZFCM(-) solo all’interno di un armadio di biosicurezza e realizzare regolarmente nuovi supporti ZFCM(-) (…

Materials

35-mm culture dish	Sarstedt	83-3900
35-mm glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Cover glass	Corning	2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	26140087
Glucose	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Injection Mold	Adaptive Science Tools	TU-1
Inverted Microscope	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Low melting agarose	Promega	V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Phenol Red	Sigma Aldich	P0290
Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldich	P7629
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	PV820
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma Aldich	P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Recombinant mouse slit2	R&D Systems	5444-SL-050
Sodium Pyruvate	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0.22 µm filter	Millipore	S2GPT05RE
TE Buffer	Ambion	AM9860
Tricaine Methanesulfonate	Sigma Aldich	E10521
Vertical Pipette Puller	David Kopf Instruments	700C