Summary

プリンデキストラン硫酸ナトリウムによる大腸炎モデルにおける腸内炎症の系統的採点解析

Published: February 14, 2021
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Summary

無料のコンピュータ支援システムを用いた腸内炎症の系統的採点は、潰瘍および炎症性変化の存在を特徴とする大腸炎モデルにおける組織病理学的変化を定量的に比較する強力なツールである。組織学的大腸炎スコア評価は臨床観察を強化し、データ解釈を促進する。

Abstract

マウス大腸炎モデルは、炎症性腸疾患の病態生物学を理解することに焦点を当てた研究で広く採用されているツールです。.しかし、疾患重症度の客観的かつ再現可能な定量化のための堅牢な基準は、依然として定義されている。大腸炎分析法の多くは、腸管の小さなセグメントの限られた組織学的スコアリングに依存し、部分的または偏った分析につながる。ここでは、大腸全体の高解像度画像取得と縦断分析を組み合わせて、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発型マウス大腸炎の腸内損傷および潰瘍を定量化する。このプロトコルは、広範なユーザーの訓練なしで客観的で再現可能な結果の生成を可能にします。ここでは、DSS誘導大腸炎のデータ例を用いて、サンプル調製と画像解析に関する包括的な詳細を提供します。この方法は、粘膜損傷に関連する重大な炎症を有するマウス大腸炎の他のモデルに容易に適応することができる。我々は、結腸の全長に対する炎症/負傷および浸食/潰瘍化された粘膜の割合が、DSS誘発疾患の進行の中での体重減少などの臨床所見と密接に類似していることを示す。この組織学的プロトコルは、DSS大腸炎実験において、疾患活動の分析を公平に標準化するための、信頼できる時間と費用対効果の高い援助を提供します。

Introduction

消化管上皮バリアは、下層の組織区画1から発光抗原および病原体を分離する上で極めて重要な役割を果たす。炎症性腸疾患(IBD)、虚血、または外科的傷害などの病理学的状態で見られる上皮損傷および粘膜創傷は、下痢、体重減少、便中の血液、および腹痛を含む臨床症状に関連している。傷害に対して、上皮細胞は粘膜バリア欠陥を再上皮化および修復するために移動し、増殖する。炎症の解決と粘膜完全性の払戻は、腸粘膜恒常性および機能2、3、4を再確立するために極めて重要である。

腸上皮バリアの損傷に関連する基礎的な分子メカニズムを研究するために、様々な動物モデルが採用されています。化学的に誘発された大腸炎の確立された、容易に適用可能なモデルは、特にIBDのような炎症性傷害に関連する研究において広く使用されている。一般的な、再現性、信頼性の高いマウス大腸炎モデルは、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)媒介大腸損傷および炎症を採用しています。疾患の重症度は、マウス株、DSSの用量、DSS投与の長さ、およびDSS5、6、7の分子量によって異なる。

DSS大腸炎中の腸粘膜損傷は、通常、体重減少、便血量、および便の一貫性によって決定される複合スコアである疾患活性指数(DAI)を用いて評価される。便の血液量は、微視的(便グアイアック酸試験を使用して検出)または巨視的であり得る。便の一貫性は、硬、軟、または液体(すなわち、下痢)5、8に分類される。これらの臨床パラメータのスコア付けは主観的であり、ユーザーの経験やバイアスによって異なる可能性がありますが、全体的にはデータが信頼できる情報を提供し、IBDの研究者によって広く使用されています。対照的に、粘膜損傷の組織学的評価のための一般的に受け入れられている方法はない。最も一般的には、結腸の選択された領域は、訓練を受けた病理学者によって検査され、通常、脊髄損傷および白血球浸潤9、10、11を含むいくつかのパラメータに基づいて採点される。しかし、調査対象のパラメータの数と分析した組織の量は個々の報告によってかなり異なるため、多くの公表された研究の比較可能性は限られている。観察者の偏見を減らし、研究間のコンコーダンスを強化するために、理想的な組織学的スコアリングプロトコルは、腸粘膜の炎症が最も頻繁に可変であり、スキップ病変が一般的であるため、結腸の全長を含むべきである、2)特定のキーに限定分析し、主観性を低下させるために容易に解釈可能なパラメータ、3)多数のサンプルの高速で一貫した処理を容易にし、4)広く利用可能で手頃な価格のツールを使用してデータを取得し、4)広く利用可能で手頃な価格のツールを使用する。

ここでは、小腸の結腸全体または長いセグメントを「スイスロール」構成で処理する技術と、DSS誘発性大腸炎による腸粘膜炎症および損傷を分析するための無料のコンピュータ支援スコアリングシステムの使用について説明する。

Protocol

記述されたすべての動物実験は、ミシガン大学動物の使用とケアに関する委員会によって承認されました。 1. 組織収穫 イオブルラン麻酔を使用してマウスをヒューマニゼーズし、その後に子宮頸部脱臼を承認されたプロトコルに従って安楽死させる。すべての動物実験について、動物の取り扱いに関する国内および制度上のガイドラインに従って、認定審査委員…

Representative Results

DSSチャレンジ後の粘膜損傷とその後の大腸炎からの回復の文脈におけるこの組織学的大腸炎スコア分析の信頼性を説明するために、我々は8つの10週齢の雄C57BL6野生型マウスの飲料水中に2.5%のDSSを5日間投与し、その後5日間の規則的な水で回復期間を行った。DSSの急性投与中に体重に変化はなく、0日目から5日目(図4A)まで。体重は、マウスが通常?…

Discussion

私たちの組織学的大腸炎スコアシステムは、腸の組織の炎症や損傷を定量化するための信頼性の高いツールを構成します。このアプローチは、小さな領域や不完全なセクションを選択するバイアスなしで、器官全体の組織病理学的状態の理解を改善します。このプロトコルを正常に実行するための重要なステップの中には、コロンの長さの少なくとも90%の分析を可能にするスイスロールの適?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、NIHの資金調達DK055679、DK089763、DK079392、DK061739、DK072564およびミシガン大学病理学スライドスキャンサービスからの支援を認めたい。

Materials

Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning Leica Biosystems Aperio AT2
Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier VWR International 56616-032
American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg GT Midwest TL5837
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles Fisher scientific 14-823-2A
Bonn Strabismus Scissors – ToughCut Fine Science tools 11103-09
Bonn Strabismus Scissors – ToughCut Fine Science tools 14084-09
Dumont #5 Forceps Fine Science tools 11251-20
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501640-19L
HistoPrep 70% Ea Fisherbran 70% denatured ethyl alcohol
ImageScope Aperio Version 12.3.3.5039 http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/
LeakBuster Specimen Containers: Sterile Starplex Scientific B120210
Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium Corning 21-040-CV
Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm Instech FTP2030
PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in BD (Becton, Dickinson and Company) 305176
PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in BD (Becton, Dickinson and Company) 305109
Syringe, 10 ml BD (Becton, Dickinson and Company) 302995
Unisette Tissue Cassettes Simport M505-2

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Cite This Article
Garcia-Hernandez, V., Neumann, P., Koch, S., Lyons, R., Nusrat, A., Parkos, C. A. Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model. J. Vis. Exp. (168), e62135, doi:10.3791/62135 (2021).

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