Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz kombiniert, um schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA zu visualisieren. Dieses Protokoll kann das Verständnis der molekularen Eigenschaften von SARS-CoV-2 RNA-Host-Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene erhöhen.
Dieses Manuskript enthält ein Protokoll für die In-situ-Hybridisierungs-Kettenreaktion (HCR) in Verbindung mit Immunfluoreszenz zur Visualisierung des schweren akuten Atemwegssyndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in Zelllinie und dreidimensionalen (3D) Kulturen des menschlichen Atemwegsepithels. Die Methode ermöglicht eine hochspezifische und sensible Visualisierung viraler RNA, indem sie sich auf HCR stützt, die durch Diesonlokalisierung initiiert werden. Split-Initiator-Sonden helfen, das Signal durch fluoreszierend markierte Verstärker zu verstärken, was zu einer vernachlässigbaren Hintergrundfluoreszenz in der konfokalen Mikroskopie führt. Etikettierverstärker mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen erleichtern die gleichzeitige Erkennung verschiedener Targets. Dies wiederum ermöglicht die Kartierung der Infektion in Geweben, um die virale Pathogenese und Replikation auf einzelzellarer Ebene besser zu verstehen. Die Kopplung dieser Methode mit der Immunfluoreszenz kann ein besseres Verständnis der Wirts-Virus-Wechselwirkungen erleichtern, einschließlich einer Abwechslung des Wirtsepigenoms und der Immunantwortwege. Dank der sensiblen und spezifischen HCR-Technologie kann dieses Protokoll auch als Diagnosetool verwendet werden. Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Technik leicht modifiziert werden kann, um den Nachweis von RNA zu ermöglichen, einschließlich nicht-kodierender RNAs und RNA-Viren, die in der Zukunft entstehen könnten.
SARS-CoV-2 ist ein neuartiges humanes Betacoronavirus, das Ende 2019 auftauchte und wenige Monate später eine beispiellose Pandemie verursachte. Da das Virus neu in der Wissenschaft ist, bleibt ein Großteil seiner Biologie und seiner Auswirkungen auf Wirtszellen unbekannt. Daher ist die Kartierung der Virus-Zell- und -Gewebetropismus während der Infektion wichtig, wenn ihre grundlegenden biologischen Eigenschaften und ihre Auswirkungen auf den Wirt zu verstehen sind. Mehrere Techniken werden verwendet, um das Zusammenspiel von Virus-Host zu untersuchen, einschließlich biochemischer, biologischer und physikalischer Assays. In-situ-Hybridisierung ist eine gängige Methode, die markierte komplementäre DNA,RNA oder modifizierte Nukleinsäuresonden verwendet, die sich auf bestimmte DNA- oder RNA-Sequenzen in einer Zelle oder einem Gewebe lokalisieren.
Es wurde eine neue RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungsmethode (RNA-FISH) entwickelt, die Modifikationen zur Erhöhung der Empfindlichkeit durch Verstärkung des Signal-Rausch-Verhältnisses über ein HCR1enthält. HCR ermöglicht die Untersuchung der RNA-Lokalisierung auf einzelliger Ebene. Aufgrund ihrer hohen Spezifität, Empfindlichkeit und Auflösung ist diese Methode nicht nur für wissenschaftliche Grundlagenstudien nützlich, sondern auch für Applikationsprojekte, z. B. Diagnostik. Kürzlich wurde die Machbarkeit dieser Methode für den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA demonstriert, die lokalisiert ist, um Ciliated-Zellen in vollständig differenzierten 3D-Human-Atemwegsepithel-Kulturen (HAE)-Kulturen2. HAE-Kulturen stellen eines der fortschrittlichsten Werkzeuge zur Untersuchung von Virusinfektionen im Kontext der Mikroumgebung “natürliche Infektion”3,4dar.
Mehrere Berichte über humane Coronaviren (HCoV), einschließlich SARS-CoV-2, unterstreichen die Bedeutung epigenetischer Modifikationen in Bezug auf HCoV-Infektion und Pathophysiologie [überprüft in 5], z. B. das Methylierungsmuster des Gens, das das Angiotensin-convertierende Enzym 2 (ACE-2)-Rezeptor6,7kodiert. Interessanterweise identifizierte das massenspektrometrische Screening mehrere epigenetische Faktoren, die mit dem SARS-CoV-2-Proteom8interagieren. Genauer gesagt bindet das nichtstrukturelle Protein 5 (NSP5) an den epigenetischen Regulator, Histondeacetylase 2, und das katalytisch inaktive NSP5 (C145A) interagiert mit tRNA-Methyltransferase 1 (24). Zusätzlich wird die NSP16-Methyltransferase-Aktivität durch den Methyltransferase-Inhibitor Sinefungin9blockiert. Die genaue Rolle dieser epigenetischen Faktoren bei COVID-19 bleibt jedoch unklar. Die Replikation von HCoV erfolgt im Zytoplasma der infizierten Zelle und löst Entzündungsreaktionen aus, die durch epigenetische Modifikationen reguliert werden10.
Zum Beispiel verfeinert HCoV-229E die Atomfaktor-Kappa B-Signalisierung und programmiert die hostzelluläre Chromatinlandschaft tiefgreifend um, indem die Acetylierung von H3K36 und H4K5 in bestimmten Regionen erhöht wird11. Die mit dem Middle East respiratorische Syndrom zusammenhängende Coronavirus-Infektion erhöht den Gehalt an H3K27me3 und erschöpft H3K4me3 in den Promotorregionen von Teilmengen spezifischer interferonempfindlicher Gene12. Zusätzlich löst virale RNA Immunreaktionen aus, wie bei den Flaviviren13, Retroviren14,15und Coronaviren16nachgewiesen. Die epigenetischen Marker auf viraler RNA können eine Rolle bei der Erkennung durch zelluläre Sensoren spielen, wie für die m7A-Methylierung des humanen Immundefizienzvirus-1-RNA17gezeigt. Es bleiben jedoch Fragen: Welche Auswirkungen hat SARS-CoV-2 RNA auf die Immunantwort, und sind epigenetische Markierungen beteiligt?
Hier wurde eine optimierte RNA-FISH-Methode in Verbindung mit der Immunfluoreszenzanalyse von Zelllinien und 3D-Geweben (voll differenzierte se) beschrieben. Obwohl zytologische Methoden wie FISH und Immunfluoreszenz weit verbreitet sind, wurde diese auf HCR basierende In-situ-Hybridisierungsmethode der neuen Generation nie für den Virennachweis verwendet (außer in einer kürzlich veröffentlichten Publikation)2. Im Allgemeinen erfordern Immunfärbung und FISH die folgenden Schritte: Permeabilisierung, um das Eindringen von Sonden oder Antikörpern zu ermöglichen; Fixierung, bei der zelluläres Material fixiert und konserviert wird; Nachweis, bei dem Antikörper oder Nukleinsäuresonden aufgetragen werden; und schließlich Montage der Proben zur Visualisierung.
Obwohl bestehende Protokolle diese allgemeinen Funktionen gemeinsam nutzen, unterscheiden sie sich in Bezug auf die beteiligten Parameter deutlich. Hier wurde ein optimiertes, einfaches Immun-RNA-FISH-Protokoll zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in HAE-Kulturen und Vero-Zellen beschrieben. Die Technik umfasst die folgenden Schritte: (1) Fixierung von Zellen mit Paraformaldehyd; (2) Permeabilisation mit Waschmittel oder Methanol (MeOH); (3) Rehydratation durch eine abgestufte Reihe von MeOH-Lösungen (nur HAE-Kulturen); (4) Erkennung; (5) Amplifikation mit HCR-Technologie zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA; (6) Immunfärbung; und (7) Bildgebung unter einem konfokalen Mikroskop.
Immuno-RNA-FISH ist eine zuverlässige Methode zur Doppelfärbung von RNA und zellulären Proteinen. Hier wurde ein modifiziertes Immun-RNA-FISH-Protokoll beschrieben, das den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA und zellulären Proteinen in Zelllinien und HAE-Kulturen ermöglicht. Dieses Protokoll kann für den Einsatz in verschiedenen Zellmodellen angepasst werden, einschließlich Zellmonolayern oder spezifischen Geweben. Die Methode basiert auf dem Konzept eines HCR, das durch entsprechende Sondenlokalisierung initiiert wird. …
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung für die Forschung zu SARS-CoV-2 und durch Stipendien des National Science Center (Stipendien UMO2017/27/B/NZ6/02488 an K.P. und UMO-2018/30/E/NZ1/00874 an A.K.-P.) unterstützt.
Equipment | |||
Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
Materials | |||
15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
12-well plate | TTP | 92412 | |
Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
Reagents | |||
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
Software | |||
Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |