عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L
Summary
تسمح نماذج الماوس بدراسة الآليات الرئيسية لعدم انتظام ضربات القلب. لهذا الغرض ، تعد خلايا عضلة القلب عالية الجودة ضرورية لإجراء قياسات المشبك الرقعة. هنا ، يتم وصف طريقة لعزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عن طريق نضح لانجيندورف القائم على الإنزيم الرجعي ، والذي يسمح بالقياسات المتزامنة لعابرات الكالسيوم وتيار الكالسيوم من النوع L.
Abstract
تلعب نماذج الفئران دورا مهما في أبحاث عدم انتظام ضربات القلب وتسمح بدراسة الآليات الرئيسية لتكوين عدم انتظام ضربات القلب بما في ذلك وظيفة القناة الأيونية المتغيرة ومعالجة الكالسيوم. لهذا الغرض ، تعد خلايا عضلة القلب الأذينية أو البطينية ذات الجودة العالية ضرورية لإجراء قياسات المشبك التصحيحي أو لاستكشاف تشوهات التعامل مع الكالسيوم. ومع ذلك ، فإن العائد المحدود لخلايا عضلة القلب عالية الجودة التي تم الحصول عليها بواسطة بروتوكولات العزل الحالية لا يسمح بكلا القياسين في نفس الماوس. توضح هذه المقالة طريقة لعزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة عن طريق نضح لانجيندورف القائم على الإنزيم الرجعي ، لإجراء قياسات متزامنة لاحقة لعابرات الكالسيوم وتيار الكالسيوم من النوع L من واحد. يتم الحصول على قلوب الفئران ، ويتم تقليب الشريان الأورطي بسرعة لإزالة الدم. ثم يتم ترشيح القلوب في البداية بمحلول خال من الكالسيوم (37 درجة مئوية) لفصل الأنسجة على مستوى الأقراص المقحمة وبعد ذلك بمحلول إنزيم يحتوي على القليل من الكالسيوم لتعطيل المصفوفة خارج الخلية (37 درجة مئوية). يتم تشريح القلب المهضوم لاحقا إلى الأذينين والبطينين. يتم تقطيع عينات الأنسجة إلى قطع صغيرة وتذويبها عن طريق سحب الماصة بعناية لأعلى ولأسفل. يتم إيقاف الهضم الأنزيمي ، ويتم إعادة إدخال الخلايا تدريجيا إلى تركيزات الكالسيوم الفسيولوجية. بعد التحميل باستخدام مؤشر Ca2+ الفلوري ، يتم تحضير خلايا عضلة القلب المعزولة للقياس المتزامن لتيارات الكالسيوم والعابرة. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة مزالق العزل ويتم توفير بروتوكولات المشبك التصحيحي والآثار التمثيلية لتيارات الكالسيوم من النوع L مع قياسات عابرة متزامنة للكالسيوم في الخلايا العضلية الأذينية والبطينية المعزولة كما هو موضح أعلاه.
Introduction
عدم انتظام ضربات القلب شائع وأحد تحديات الرعاية الصحية الرئيسية الحالية لأنها تؤثر على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم. يرتبط عدم انتظام ضربات القلب بارتفاع معدلات المراضة والوفيات 1,2 ويمثل السبب الكامن وراء غالبية الوفيات القلبية المفاجئة3. أدت خيارات العلاج الحديثة إلى تحسين بقاء المريض على قيد الحياة ولكنها لا تزال علاجات الأعراض بشكل أساسي بدلا من استهداف الآليات الأساسية. وبالتالي ، فإن هذه العلاجات لها فعالية محدودة وقد تسبب في كثير من الأحيان آثارا جانبية شديدة4،5،6. يتطلب تحسين خيارات العلاج الحالية نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا المرضية الأساسية ، مما يخلق الحاجة إلى نماذج مناسبة للدراسة. تلعب النماذج الحيوانية الصغيرة – وتحديدا نماذج الفئران – دورا حاسما في أبحاث عدم انتظام ضربات القلب لأنها تسمح بدراسة الآليات الرئيسية لتكوين عدم انتظام ضربات القلب ، على سبيل المثال التأثير الجيني على الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية أو وظيفة القناة الأيونية أو معالجة الكالسيوم 7,8.
لهذا الغرض ، هناك حاجة إلى خلايا عضلة القلب الأذينية والبطينية المعزولة بكمية كافية وقابلية للحياة. تم وصف مجموعة واسعة من مناهج العزل المختلفة للحصول على الخلايا العضلية الأذينية والبطينيةسابقا 9،10،11،12،13 وقدمت بعض المجموعات بيانات من القياسات المتزامنة للتيار من النوع L والكالسيوم الناجم عن الكالسيوم العابر من الأذين 14 أو البطين 15 خلايا عضلة القلب الفئران. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لا توجد بيانات متاحة عن قياسات الأذين والبطين من واحد. يركز الباحثون على مجموعة واسعة من الموضوعات التي تتراوح من الفيزيولوجيا الكهربية إلى البروتينات ، والدراسات الوظيفية مثل انقباض الخلايا أو تفاعلات البروتين ، أو وظيفة الميتوكوندريا ، أو علم الوراثة – وكلها بحاجة إلى خلايا عضلية قلبية معزولة. وبالتالي ، لم يتم تطوير العديد من البروتوكولات المنشورة خصيصا لدراسات المشبك التصحيحي ، مما أدى إلى غلة محدودة وجودة خلية غير كافية لدراسات مشبك التصحيح. وبالتالي ، لا يمكن إجراء قياسات متزامنة لمشبك التصحيح والكالسيوم العابر للخلايا الأذينية والبطينية المعزولة من واحد باستخدام البروتوكولات المعمول بها.
لا يزال عزل الخلايا العضلية للفئران – وخاصة الأذينية – لتجارب المشبك الرقعة أمرا صعبا. توفر هذه المقالة طريقة بسيطة وسريعة لعزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة عن طريق نضح لانجيندورف القائم على الإنزيم الرجعي ، والذي يسمح لاحقا بإجراء قياسات متزامنة لكل من تيار الغشاء الصافي وعابرات الكالسيوم المستحثة الحالية من واحد. توضح هذه المقالة بروتوكولا لعزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية المشتقة من الفئران البرية والفئران التي تحمل طفرات جينية. يمكن استخدام هذا البروتوكول للفئران الذكور والإناث على حد سواء. تم الحصول على عزل الخلايا العضلية والصور والنتائج التمثيلية الموضحة أدناه من الفئران البرية من النوع C57Bl / 6 في عمر 6 (± 1) أشهر. ومع ذلك ، فقد تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح للفئران في مختلف الأعمار التي تتراوح من 2 إلى 24 شهرا مع أنماط وراثية مختلفة. يوضح الشكل 1 إعداد العزل ولقطة مقربة لقلب مقنن أثناء التروية الإنزيمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر هذه المقالة طريقة سهلة وعملية للحصول على الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة من نفس الماوس لدراسات المشبك التصحيحي مع تسجيلات الكالسيوم العابرة المتزامنة. تعتمد جودة البيانات التي تم الحصول عليها بشكل كبير على جودة عزل الخلية. كما ذكر أعلاه ، تم وصف العديد من الطرق لعزل …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG; برنامج العالم السريري في طب الأوعية الدموية (PRIME) ، MA 2186 / 14-1 إلى P. Tomsits و D. Schüttler ؛ مشروع VO1568 / 3-1 و IRTG1816 و SFB1002 A13 إلى N. Voigt) ، مؤسسة الأبحاث الألمانية في إطار استراتيجية التميز الألمانية (EXC 2067/1- 390729940 إلى N. Voigt) ، المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK ؛ 81X2600255 إلى S. Clauss و N. Voigt ؛ 81Z0600206 إلى S. Kääb) ، مؤسسة كورونا (S199 / 10079/2019 إلى S. Clauss) ، ERA-NET حول أمراض القلب والأوعية الدموية (ERA-CVD ؛ 01KL1910 إلى S. Clauss) ، مؤسسة هاينريش ولوت مولفينزل (إلى S. Clauss) ومؤسسة Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 إلى N. Voigt). لم يكن للممولين أي دور في إعداد المخطوطات.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. Cardiac safety assays. Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O’Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
