Mäuse wurden in der Plaisant Animal Facility untergebracht, und die Arbeit wurde unter der Genehmigungsnummer 1065/2015-PR des italienischen Gesundheitsministeriums durchgeführt. Das Protokoll folgte den Tierpflegerichtlinien gemäß den nationalen und internationalen Gesetzen und Richtlinien (EU-Richtlinie 2010/63/EU; Italienisches Gesetzesdekret 26/2014). 1. Herstellung von Medium und Färbelösung Bereiten Sie ein komplettes Medium vor: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 2 mM Glutamin, 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, 50 μM Beta-Mercaptoethanol und 10% Volumen / Volumen (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) Färbepuffer vorbereiten: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+/Mg2+ (PBS) mit 1% Gewicht/Volumen (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA) 2. Behandlung mit der Maus Prime 7-8 Wochen alte, weibliche Balb/c-Mäuse durch intramuskuläre (i.m.) Injektion in den Quadrizeps des humanen Immundefizienz-Virus (HIV)-1-gag-exprimierenden-Schimpansen-Adenoviralvektors (ChAd3-gag) mit einer Dosis von 107 Viruspartikeln. 1-4 Monate nach der Grundierung verstärken die Mäuse einmal durch i.m. Injektion des HIV-1-Gag-exprimierenden modifizierten Vaccinia Ankara Virus (MVA-Gag) mit einer Dosis von 106 plaquebildenden Einheiten. Am Tag 3 nach dem Boost opfern Sie die verstärkten Mäuse durch zervikale Luxation und analysieren Sie sie parallel zu unbehandelten Mäusen. Ernten Sie die LNs, die den Quadrizeps (Becken, Kniekehle und Leisten) und die Milz von verstärkten und unbehandelten Mäusen entwässern. Sammeln Sie außerdem die BM von den beiden Hinterbeinen von unbehandelten Mäusen und verwenden Sie diese BM für Durchflusszytometereinstellungen und als Positivkontrolle für die Zellzyklusanalyse (Abbildung 2).HINWEIS: Generieren Sie ChAd3-Gag- und MVA-Gag-Vektoren wie zuvor beschrieben12,15,16,17. 3. Isolierung von drainierenden LN-, Milz- und BM-Zellen Isolierung von Milz- und LN-Zellen Legen Sie 5 ml komplettes Medium in jedes der beiden 15-ml-Röhrchen und bewahren Sie sie auf Eis auf, bereit für die Entnahme von Organen. Opfern Sie eine erwachsene Maus durch zervikale Luxation. Legen Sie die Maus auf den Rücken und sterilisieren Sie die Hautoberfläche mit 70% v / v Ethanol. Um Leisten-LNs zu sammeln, machen Sie einen ~ 1 cm langen Schnitt am Bauch mit einer Schere und dehnen Sie den Schnitt mit der Pinzette. Visualisieren Sie Leisten-LNs auf der inneren Oberfläche der Haut und ernten Sie sie mit der Pinzette. Legen Sie die Leisten-LNs in eines der beiden in Schritt 3.1.1 vorbereiteten 15-ml-Röhrchen. Um die Milz zu sammeln, machen Sie einen Peritonealschnitt mit einer Schere und entfernen Sie die Milz. Nach dem Schneiden des umgebenden Bindegewebes wird die Milz in das zweite 15-ml-Röhrchen gegeben, das in Schritt 3.1.1 vorbereitet wurde. Um Becken-LNs zu sammeln, bewegen Sie den Darm zur Seite und visualisieren Sie Becken-LNs in der Nähe der unteren Hohlvene und sammeln Sie sie dann mit der Pinzette. Legen Sie die Becken-LNs in dasselbe Röhrchen, das die Leisten-LNs enthält.HINWEIS: Um genügend LN-Zellen für die Färbung zu erhalten (siehe Abschnitt 4), ist es häufig notwendig, Popliteal-, Leisten- und Becken-LNs einer Maus zu bündeln. Diese LNs entwässern alle den Quadrizeps (die Stelle der i.m. Impfung). Dieses Protokoll verwendet nur eine 15-ml-Röhre aus gepoolten LNs. Um Kniekehlen-LNs zu sammeln, greifen Sie die Haut der Hinterbeine und ziehen Sie sie sanft nach unten, um die Muskeln freizulegen. Führen Sie dann die Pinzette zwischen den Muskeln unter dem Kniegelenk ein und sammeln Sie die Kniekehlen-LNs. Legen Sie die Kniekehlen-LNs in die gleiche Röhre, die Leisten- und Becken-LNs enthält.ANMERKUNG: Siehe Anmerkung nach 3.1.7. Legen Sie die Milz in ein 70 μm Zellsieb in eine 60 mm Kulturschale, die mit 5 ml komplettem Medium gefüllt ist. Mit einem 5-ml-Spritzenkolben das Organ vorsichtig zerdrücken, bis es vollständig disaggregiert ist. Entfernen Sie das Sieb und geben Sie die Zellsuspension in ein sauberes 15-ml-Röhrchen. Geben Sie 5 ml komplettes Medium in die Kulturschale und waschen Sie die Schale und das Sieb sorgfältig ab, um sicherzustellen, dass alle Zellen wiederhergestellt wurden. Mit dem Rest der Milzzellensuspension in das 15-ml-Röhrchen einfließen lassen. Für die gepoolten Leisten-, Becken- und Popliteal-LNs wird eine Einzelzellsuspension nach einem ähnlichen Verfahren wie in den Schritten 3.1.9 bis 3.1.11 für die Milz hergestellt. Zentrifugenzellen bei 400 × g für 10 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in PBS. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer unter Verwendung eines Lysepuffers für rote Blutkörperchen und 0,04% v / v Trypanblau in PBS. Isolierung von BM-Zellen Legen Sie 5 ml komplettes Medium in ein 15 ml Rohr und bewahren Sie es auf Eis auf, bereit für die Sammlung von Hinterbeinen. Opfern Sie eine erwachsene Maus durch zervikale Luxation. Sterilisieren Sie die Hautoberfläche mit 70% v/v Ethanol. Machen Sie mit einer Schere einen ~ 1 cm langen Querschnitt auf der ventralen Haut, greifen Sie die Haut auf beiden Seiten des Schnitts fest und ziehen Sie ihn vorsichtig nach unten, um die Muskeln der Hinterbeine freizulegen. Um die Haut von der Rückseite der Hinterbeine zu entfernen, halten Sie die Maus in Rückenlage, legen Sie die Klemme unter das Knie und ziehen Sie nach oben, um die Muskeln freizulegen. Schneiden Sie die Knochen an den beiden Extremitäten eines Hinterbeins ab: dem Becken- / Hüftgelenk und dem Knöchel. Beide Hinterbeine werden in das in Schritt 3.2.1 vorbereitete 15-ml-Röhrchen überführt. Halten Sie die Röhre auf Eis. Nehmen Sie die Hinterbeine aus dem 15-ml-Röhrchen und übertragen Sie sie auf Seidenpapier. Schneiden Sie die Hinterbeine direkt unter dem Kniegelenk ab, um die Tibia zu entfernen. Sezieren Sie den Femur und die Tibia von den umliegenden Muskeln, entfernen Sie überschüssiges Gewebe mit einer Schere und befeuchten Sie das Seidenpapier. Schneiden Sie die Knochenenden mit einer Schere ab, um den inneren Markschaft freizulegen. Tibia und Femur in das BM-Extraktionsröhrchen einführen (siehe Vorbereitung in 3.2.9.1-3.2.9.218), wobei das breiteste Ende unten ist. Schneiden Sie eine 200-μL-Pipettenspitze an der Linie knapp über dem Ende der Spitze und an der 100-μL-Linie. Legen Sie den mittleren Teil in den oberen, größeren Teil der Spitze und legen Sie diesen in ein 1,5 ml Mikrofugenrohr. Das BM-Extraktionsrohr bei 800 × g für 1 min drehen. Entsorgen Sie den Knochen und resuspen sie das Pellet kräftig in 1 ml vollständigem Medium, um alle Cluster zu entfernen. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 70-μm-Filter, der auf der Oberseite eines 15-ml-Röhrchens angebracht ist. Waschen Sie das BM-Extraktionsrohr zweimal mit jeweils 1 ml vollständigem Medium. Durch einen 70-μm-Filter filtriert und das Volumen mit dem Rest der in Schritt 3.2.11 erhaltenen Zellsuspension zusammenfasst.HINWEIS: Ein einzelnes 15-ml-Röhrchen enthält Zellen aus beiden Hinterbeinen einer Maus. Zentrifugenzellen bei 400 × g für 10 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer unter Verwendung eines Lysepuffers für rote Blutkörperchen und 0,04% v / v Trypanblau in PBS. 4. Färbung von Milz-, LN- und BM-Zellen Teilen Sie die zu färbenden Zellproben in 3 Untergruppen auf: Zellproben zur Kompensation,einschließlich BM-Zellen von unbehandelten Mäusen, die nur mit Hoechst 33342 (im Folgenden als Hoechst bezeichnet) gefärbt werden sollen, und Milzzellen von unbehandelten Mäusen, die zur Herstellung einer Tot-/Lebendzellmischung für die Kompensation von Totzellenfarbstoffen verwendet werden; Positivkontrolle für die Zellzyklusanalyse, bestehend aus einer BM-Probe von unbehandelten Mäusen; und experimentelle Proben, die Milz- und LN-Proben von unbehandelten und geimpften Mäusen enthalten.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass genügend Milz- und LN-Zellen für die Analyse einer ausreichenden Anzahl von Gag-spezifischen CD8-T-Zellen vorhanden sind. Es ist oft notwendig, gepoolte Milzzellen und gepoolte LN-Zellen von 3 geimpften Mäusen zu verwenden und zwei oder mehr identische Proben von gepoolten Zellen zu färben, die jeweils 3 × 10 6 Zellenenthalten. Identische Proben beim Hoechst-Färben zusammenführen. In ähnlicher Weise färben Sie gepoolte Milzzellen und LN-Zellen von 3 unbehandelten Mäusen und verschmelzen identische Proben am Ende. Legen Sie eine nicht gefärbte Probe von Milzzellen von einer unbehandelten Maus beiseite, um sie für die Einrichtung von Instrumenten und Kompensationen zu verwenden. Bereiten Sie die Mischung aus toten / lebenden Zellen für die Kompensation von Totzellfarbstoffen vor (diese Zellmischung wird nur mit dem Totzellfarbstoff angefärbt). Ein Wasserbad bei 65 °C erhitzen. Nehmen Sie ein Aliquot von Milzzellen (~ 3 × 106). Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Mikrofugenröhrchen, legen Sie sie für 5 min in das Wasserbad bei 65 °C und legen Sie sie dann sofort für 10 min auf Eis. Mischen Sie die hitzeabgetöteten Zellen mit lebenden Milzzellen (~ 3 × 10 6 ) ineinemVerhältnis von 1: 1 und übertragen Sie die Hälfte der Mischung auf eine 96 well-runde Bodenplatte (~ 3 × 106 Zellen / Well für die Totzellfärbungskontrolle). Totzellfärbung experimenteller Proben, Positivkontrolle für Zellzyklusanalyse und Tot-/Lebendzellmischung Milz- und LN-, BM-Zellen (3 × 106 Zellen/Well) und das Tot-/Lebendzellgemisch (Abschnitt 4.2) gemäß dem Färbeschema (Schritt 4.1) in die 96-Well-Rundbodenplatte überführen und bei 400 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren. Resuspend jedes Zellpellet in 50 μL toter Zellfarbstoff, verdünnt in PBS, und resuspend durch pipettieren Sie sofort 3 Mal auf und ab. 30 min bei 4 °C vor Licht geschützt inkubieren. Zellen 2 mal mit Färbepuffer waschen; das erste Mal mit 200 μL und das zweite Mal mit 250 μL. Für jede Waschzentrifuge die Platte bei 400 × g für 3 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 20 μL PBS. Membranzellfärbung mit Major Histocompatibility Complex (MHC)-Peptid-Multimeren und mAbs. Unter Berücksichtigung der erforderlichen Volumina gemäß dem Färbeschema (Durchflusszytometereinstellungen, Tabelle 1) stellen Sie die folgenden Reagenzien her: Verdünnen Sie mAb 2.4G2 im Färbepuffer entsprechend der entsprechenden Verdünnung (siehe Tabelle der Materialien); für jede zu färbende Probe 10 μL dieser Verdünnung verwenden.HINWEIS: 2,4G2 mAb blockiert die nicht-antigenspezifische Bindung von Immunglobulinen an die FcγIII- und FcγII-Rezeptoren. Verdünnen Sie das H-2k(d) AMQMLKETI Allophycocyanin (APC)-markierte Tetramer (Tetr-Gag) im Färbepuffer, um die entsprechende Verdünnung zu erhalten (siehe Tabelle der Materialien); für jede zu färbende Probe 20 μL dieser Verdünnung verwenden. Die Antikörpermischung wird durch Verdünnen von mAbs im Färbepuffer entsprechend der entsprechenden Verdünnung (siehe Materialtabelle),die zuvor in Titrationsexperimenten bestimmt wurde, hergestellt; für jede zu färbende Probe 20 μL dieser Antikörpermischung verwenden.HINWEIS: Hier wurden Anti-CD3e-Peridinin-Chlorophyllprotein (PerCP-Cy5.5) (Klon 145-2C11), Anti-CD8a-Brillant-Ultraviolett (BUV805) (Klon 53-6.7) und Anti-CD62L-Phycoerythrin Cyanin7 (PECy7) (Klon MEL-14) verwendet. 10 μL der zuvor verdünnten 2,4G2 mAb (Schritt 4.4.1.1) zugeben und 10 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren. Fügen Sie 20 μL des zuvor verdünnten Tetr-Gag APC (Schritt 4.4.1.2) und 10 μL H-2k(d) AMQMLKETI Phycoerythrin (PE) Pentamer (Pent-Gag) hinzu. 15 min bei 4 °C vor Licht geschützt inkubieren. 20 μL der zuvor hergestellten Antikörpermischung (Schritt 4.4.1.3) zugeben und 15 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.HINWEIS: Daher beträgt das Endvolumen 80 μL pro Vertiefung (Schritt 4.3.5, Schritte 4.4.2 bis 4.4.4). Zellen mit 200 μL Färbepuffer waschen. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 250 μL Färbepuffer und übertragen Sie die Zellsuspension auf 5 ml Röhrchen. 1 ml Färbepuffer in das Röhrchen geben und bei 400 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Nehmen Sie das Aliquot von BM-Zellen (3 × 106 Zellen) (siehe Liste der Zellproben, Abschnitt 4.1), das zur Kompensation des Hoechst-Kanals verwendet werden soll (Hoechst 33342 wird durch einen ultravioletten Laser angeregt (Durchflusszytometereinstellungen (Tabelle 2)), und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 5-ml-Röhrchen. 1 ml Färbepuffer in das Röhrchen geben und 400 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. 5. Fixierung/Permeabilisierung Bereiten Sie einen frischen Fixierungs- / Permeabilisierungspuffer vor, indem Sie 1 Teil Fixierungs- / Permeabilisierungskonzentrat mit 3 Teilen Fixierungs- / Permeabilisierungsverdünnungsmittel gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen. Verwerfen Sie den Überstand und pulsieren Sie die Proben, um das Pellet vollständig zu disaggregieren. Jedem Röhrchen, einschließlich eines Rohrs mit ungefärbten Milzzellen (3 x 106,siehe Liste der Zellproben, Abschnitt 4.1) und Wirbel, wird 1 ml des frisch zubereiteten Fixations-/Permeabilisierungspuffers gegeben. 16 h bei 4 °C inkubieren.HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. 6. Intrazelluläre Färbung Ki67 Färbung Bereiten Sie frischen Permeabilisierungspuffer 1x vor, indem Sie den Permeabilisierungspuffer 10x mit destilliertem Wasser gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen. Vor der Verwendung muss der Permeabilisierungspuffer 1x durch einen 0,45 μm-Filter gefiltert werden, um Aggregate zu eliminieren. Verdünntes mAb Ki67 Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (Klon SolA15) in Permeabilisierungspuffer 1x (siehe Materialtabelle),wie zuvor in Titrationsexperimenten bestimmt (Endvolumen von 100 μL pro Probe). 3 ml Permeabilisierungspuffer 1x in jedes Röhrchen geben und bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und wiederholen Sie Schritt 6.1.3. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 100 μL zuvor verdünntem mAb Ki67 FITC (Schritt 6.1.2). 30 min bei RT inkubieren, vor Licht geschützt. Zellen 2 mal mit 4 ml Permeabilisierungspuffer 1x waschen. Für jede Waschzentrifuge bei 400 × g für 5 min bei RT. Resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS unter Berücksichtigung der folgenden Volumina: 350 μL PBS für die Proben, die direkt am Durchflusszytometer entnommen werden sollen; 250 μL PBS für die mit Hoechst kurz vor der Durchflusszytometrie zu inkubierenden Proben (Abschnitt 6.2). DNA-Färbung Zu jeder Probe werden 250 μL 4 μg/ml Hoechst in PBS gegeben (die Endkonzentration von Hoechst beträgt 2 μg/ml).HINWEIS: Falls zwei oder mehr identische Proben von 250 μL in PBS hergestellt wurden, verschmelzen Sie sie in diesem Schritt und fügen Sie das gleiche Volumen von 4 μg/ml Hoechst-Lösung in PBS hinzu (die Endkonzentration von Hoechst beträgt 2 μg/ml). Die Anzahl der Zellen beeinflusst den DNA-Färbeschritt stark. Verwenden Sie in jeder Stichprobe dieselbe Zellnummer. Beachten Sie, dass selbst eine leicht reduzierte Zellzahl (z.B. durch Zellverlust in früheren Waschschritten) zu einer höheren Hoechst-Bindung an DNA und einer höheren Hoechst-Intensität führt. 15 min bei RT inkubieren, vor Licht geschützt. Zentrifugieren Sie die Proben bei 400 × g für 5 min bei RT. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 350 μL PBS. 7. Vorbereitung von Kompensationsperlenproben Bereiten Sie 5 μL des Antikörpers vor, indem Sie mAb im Färbepuffer entsprechend verdünnen.ANMERKUNG: Bereiten Sie für jedes fluorchromkonjugierte mAb, das im Experiment verwendet wird, die entsprechende Kompensationsperlenprobe vor. Vortex Negative Control und Anti-Rat/Hamster Ig,κ Comp Beads vor Gebrauch. Geben Sie für jede Probe einen Tropfen (~ 20 μL) Negativkontroll-CompBeads und einen Tropfen Anti-Ratten/Hamster-Ig,k CompBeads ein. 5 μL des vorverdünnten Antikörpers (Schritt 7.1) in das Röhrchen geben und auf und ab pipettieren. 15 min bei 4 °C vor Licht geschützt inkubieren. Proben mit 2 mL Färbepuffer waschen. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie 500 μL PBS zu jedem Rohr und Wirbel hinzufügen. 8. Instrumenten- und Kompensationsaufbau und experimentelle Probenaufnahme am Durchflusszytometer HINWEIS: Die Konfiguration des Durchflusszytometers finden Sie unter Einstellungen des Durchflusszytometers (Tabelle 2). Allgemeiner Instrumenten- und Kompensationsaufbau Öffnen Sie die Software zur Probenerfassung (siehe Materialtabelle),und erstellen Sie ein neues Experiment, indem Sie im Menübandbereich des Arbeitsbereichs auf Neues Experiment klicken und Neues leeres Experimentauswählen. Doppelklicken Sie auf das erstellte Experiment, um es zu öffnen. Klicken Sie im Fenster Zytometereinstellungen auf Parameter und wählen Sie alle Kanäle (z. B. PE, APC usw.) aus, die im Färbefenster verwendet werden, einschließlich der Parameter Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC). Wählen Sie lineare Skalierung als Hoechst-Parameter aus, indem Sie die Log-Skala deaktivieren, und überprüfen Sie die Breite (W) des Spannungsimpulses für FCS, SSC und Hoechst.HINWEIS: Alle Parameter werden standardmäßig in logarithmischer (logarithmischer) Skala angezeigt, mit Ausnahme von FSC und SSC, die im linearen Maßstab vorliegen. Alle Parameter werden durch die Fläche (A) und die Höhe (H) des Spannungsimpulses analysiert. Erstellen Sie auf dem globalen Arbeitsblattein Punktdiagramm mit FSC-A auf der x-Achse und SSC-A auf der y-Achse. Führen Sie die nicht gebeizte Milzprobe aus, indem Sie im Erfassungsdashboard auf Daten erfassenklicken. Legen Sie die entsprechenden FSC- und SSC-Einstellungen fest, um die Zellen zu visualisieren, indem Sie die Spannungswerte im Abschnitt Parameter ändern, und erstellen Sie ein Gate, um alle im FSC-A/SSC-A-Punktdiagramm angezeigten Zellen auszuwählen, indem Sie in der Workspace-Symbolleiste des globalen Arbeitsblattsauf Polygon-Gate klicken. Zeigen Sie die gated Zellen in Histogrammen mit jedem Fluoreszenzparameter auf der x-Achse an. Führen Sie ungefärbte und vollständig gefärbte Milzproben aus, um den Fluoreszenzdetektor (PMT) so einzustellen, dass er für jeden Fluoreszenzparameter eine klare Trennung zwischen negativen und positiven Signalen der gefärbten Zellen aufweist. Um die Vergütungseinrichtung durchzuführen, klicken Sie im Arbeitsbereichsmenüband auf Experiment und wählen Sie im Abschnitt Vergütungseinrichtung die Option Vergütungssteuerung erstellenaus. Deaktivieren Sie Ungefärbtes Steuerrohr/Well einschließen und klicken Sie auf OK.HINWEIS: Dieser Vorgang führt zur Erzeugung einer Probe mit dem Namen Compensation Controls und eines normalen Arbeitsblatts, das mehrere Blätter enthält, die jedem ausgewählten Parameter entsprechen. Führen Sie eine Probe von Kompensationsperlen aus (siehe Abschnitt 7); Legen Sie die entsprechenden FSC- und SSC-Einstellungen fest, um die Kügelchen zu visualisieren, indem Sie die Spannungswerte und den Erfassungsschwellenwert von 5.000 für FSC-Parameter im Zytometerfenster ändern. Passen Sie das P1-Tor auf der Perlenpopulation an und überprüfen Sie, ob die positiven und negativen Spitzen beide auf der x-Achse sichtbar sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Kompensationsperlenprobe und zeichnen Sie schließlich jede Probendatei auf, indem Sie im Erfassungs-Dashboard auf Daten aufzeichnen klicken (zeichnen Sie mindestens 5.000 Ereignisse für jede Probe auf). Stellen Sie für jede aufgezeichnete Perlenprobe die P2- und P3-Gatter auf die positiven bzw. negativen Peaks ein. Führen Sie die Zellproben zur Kompensation aus (siehe Schritte 4.2 und 4.4.7 sowie Abschnitte 5 und 6). Ändern Sie die FSC- und SSC-Spannungen und den Schwellenwert, um die Zellen zu visualisieren, passen Sie das P1-Gate an und zeichnen Sie schließlich jede Sample-Datei auf (zeichnen Sie mindestens 10.000 Ereignisse auf). Stellen Sie die P2- und P3-Gatter auf die positiven bzw. negativen Peaks ein.HINWEIS: Für die Kompensation des Hoechst-Kanals verwenden Sie G0/ G1 als negativen Peak (P3) und G2/ M als positiven (P2). Klicken Sie im Menübandbereich des Arbeitsbereichs auf Experiment und wählen Sie im Abschnitt Vergütungseinrichtung die Option Vergütung berechnenaus. Benennen Sie die erstellte Vergütungseinstellung, verknüpfen Sie sie, und speichern Sie sie im aktuellen Test. Experimentelle Probenentnahme Öffnen Sie ein Muster, indem Sie in der Symbolleiste des Browsers auf Neues Muster klicken, und erstellen Sie die Gating-Strategie im globalen Arbeitsblatt.ANMERKUNG: Die Gating-Strategie der Probenentnahme ähnelt der der Probenanalyse, die in Abbildung 3 und Abschnitt 9 beschrieben ist. Zeigen Sie alle Ereignispopulationen in einem Histogramm mit CD3-A auf der x-Achse an. Erstellen Sie ein Intervall-Gate, um nur die CD3+ -Zellen auszuwählen. Wählen Sie im ErfassungsdashboardStorage Gate als Alle Ereignisse für LN-Samples und entweder Alle Ereignisse oder CD3+ Zellen für Milzproben aus. Führen Sie die experimentellen Proben mit niedriger Geschwindigkeit aus und nehmen Sie schließlich alle Dateien auf, um sicherzustellen, dass mindestens 100-200 antigenspezifische CD8-T-Zellen für jede Probe von den geimpften Mäusen gesammelt werden.HINWEIS: Die Dateigröße experimenteller Proben ist in der Regel groß (30-120 MB), insbesondere wenn die Häufigkeit von antigenspezifischen CD8-T-Zellen niedrig ist. Daher müssen eine hohe Anzahl von Ereignissen (> 1 × 106) gesammelt werden, um mindestens 100-200 Antigen-spezifische CD8-T-Zellen zu erfassen. Große Dateien können den nachfolgenden Datenanalyseprozess verlangsamen. Die Erfassung von nur CD3+ Zellen in Milzproben (siehe Schritt 8.2.2 oben) ist hilfreich, um die Dateigröße kleiner zu halten. Führen Sie die Positivkontrolle für die Zellzyklusanalyse durch und zeichnen Sie sie auf, d. H. BM-Probe von unbehandelten Mäusen. 9. Datenanalyse Öffnen Sie die Software (siehe Tabelle der Materialien) und erstellen Sie verschiedene Gruppen, die den verschiedenen zu analysierenden Organen entsprechen, indem Sie im Menübandbereich des Arbeitsbereichs auf Gruppe erstellen klicken (d. h. Gruppe “a-LNs erstellen”; “b-Milz”; “c-BM”).HINWEIS: Neu erstellte Gruppen werden in der Gruppenliste angezeigt, während die Gruppe “Vergütung” automatisch von der Software generiert wird. Öffnen Sie das Fenster Gruppe ändern, indem Sie auf den Gruppennamen doppelklicken, und überprüfen Sie, ob die neu erstellten Gruppen synchronisiert sind. Wenn nicht, setzen Sie ein Häkchen in die Funktion Synchronisiert. Ziehen Sie jede FCS-Datei in die entsprechende Gruppe. Erstellen Sie die Gating-Strategie beginnend mit der Gruppe “a-LNs”. Doppelklicken Sie auf die vollständig gebeizte Probe in der Gruppe, um das Diagrammfenster zu öffnen. x- und y-Achse sind wie in den fcs-Dateien gekennzeichnet (siehe Durchflusszytometereinstellungen, Tabelle 2). Zeigen Sie die für diese Probe erfassten Gesamtereignisse in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und DNA-W auf der y-Achse an. Wählen Sie nur die einzelne Zellpopulation aus, indem Sie im Abschnitt Gating-Werkzeug des Diagrammfensters auf Rechteck klicken.HINWEIS: Einzelne Zellen haben DNA-A-Werte wie folgt: 2N (niedrig): zwischen 2N und 4N (intermediär) oder gleich 4N (hoch), während DNA-W-Werte für alle identisch sind (Schritt 1 von Abbildung 3). Doppelklicken Sie in die Mitte des rechteckigen Tors, um einzelne Zellen in einem Punktdiagramm mit dem Parameter FSC-A auf der x-Achse und dem Farbstoff toter Zellen auf der y-Achse anzuzeigen. Wählen Sie nur die Lebende Zellpopulation aus, indem Sie im Abschnitt Gating-Werkzeug des Diagrammfensters auf Polygon klicken. Lebende Zellen sind negativ für den toten Zellfarbstoff (Schritt 2 von Abbildung 3). Doppelklicken Sie in die Mitte des polygonalen Gatters, um die Zellen in einem Punktplot mit dem Parameter FSC-A auf der x-Achse und dem Parameter SSC-A auf der y-Achse anzuzeigen. Klicken Sie auf Rechteck, und erstellen Sie ein “entspanntes” Tor, um alle einzelnen lebenden Zellen in diesem Diagramm12 einzuschließen (Schritt 3 in Abbildung 3). Doppelklicken Sie in die Mitte des “entspannten” Tors, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit CD3 auf der x-Achse und CD8 auf der y-Achse anzuzeigen. Wählen Sie die Zellen CD3+CD8+ aus, indem Sie auf Polygon klicken (Schritt 4 in Abbildung 3). Doppelklicken Sie in die Mitte des CD3+CD8+ Gatters, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit Tetr-Gag auf der x-Achse und Pent-Gag auf der y-Achse anzuzeigen. Wählen Sie die antigenspezifischen CD8-T-Zellen (positiv für Tetr-Gag und Pent-Gag) aus, indem Sie auf Polygon klicken (Schritt 5 von Abbildung 3). Doppelklicken Sie in die Mitte des Gag-spezifischen Tors, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und Ki67 auf der y-Achse anzuzeigen (Abbildung 4). Markieren Sie die Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen, indem Sie im Gating-Werkzeugabschnitt des Diagrammfensters auf Quad klicken.HINWEIS: Zellen in der G0-Phase sind Ki67neg-DNA-niedrige Zellen (unterer linker Quadrant); Zellen in G1 sind Ki67pos-DNA niedrig (oberer linker Quadrant); Zellen in S-G2/M sind Ki67pos-DNA intermediate/high (oben rechts Quadrant) (Abbildung 4). Kopieren Sie die in einem Beispiel erstellte Gating-Strategie in die entsprechende Gruppe, um die Gatter auf alle Stichproben der Gruppe anzuwenden. Wiederholen Sie die Schritte 9.5 bis 9.18 für die “a-LN-Gruppe”. Überprüfen Sie, ob alle Tore für jede Probe der Gruppe “b-Milz” geeignet sind. Um den Zellzyklus zwischen den BM-Zellen zu analysieren (Positivkontrolle), klicken Sie in die Mitte des “entspannten” Tors, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und Ki67 auf der y-Achse anzuzeigen. Überprüfen Sie, ob alle Gatter für jede Probe der 3 Gruppen geeignet sind (d. H. Für Zellen aus Milz, LN und BM).ANMERKUNG: Das Einzelzellpopulations-Gate (Schritt 9.7) und das Quad-Gate für den Zellzyklus (Schritt 9.17) können in verschiedenen Proben unterschiedliche Gate-Koordinaten aufweisen, hauptsächlich aufgrund der möglichen geringfügigen Unterschiede der Hoechst-Farbintensität zwischen den Proben (Abschnitt 6.2). Aus diesem Grund kann es notwendig sein, das Single Cell Population Gate und die Quad Gates für den Zellzyklus in jeder Probe zu modifizieren. Dies geschieht wie folgt: Doppelklicken Sie auf den Gruppennamen und entfernen Sie die Synchronisation aus den Gruppeneigenschaften. Diese Operation ermöglicht die Modifikation der Gatter in einer Probe, ohne die gleichen Gatter in allen anderen Proben der Gruppe zu ändern. Ändern Sie nach dem Entfernen der Synchronisierung die Gates bei Bedarf. Um die Ergebnisse dieser Analyse zu visualisieren, klicken Sie im Menübandbereich des Arbeitsbereichs auf Layout-Editor, um ihn zu öffnen. Ziehen Sie jedes Gate der Gating-Strategie im Beispielbereich in den Layout-Editor, und platzieren Sie die Plots entsprechend der Reihenfolge der Gating-Strategie. Ändern Sie bei Bedarf den Diagrammtyp, indem Sie auf das entsprechende Diagramm im Layout doppelklicken und im Fenster Diagrammdefinition den entsprechenden Typ auswählen. Klicken Sie auf die Gruppe und iterieren Sie nach Funktionen auf dem Layout-Menüband, um die in jedem Organ erzielten Ergebnisse zu visualisieren und verschiedene Proben zu vergleichen.