يوفر نهج نافذة الأوعية المفتوحة باستخدام مقتفيات الفلورسنت دقة كافية لقياس تدفق الدم في القوقعة الصناعية (CoBF). تسهل هذه الطريقة دراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في CoBF في الفئران في ظل الظروف الطبيعية والمرضية.
يتطلب نقل الصوت عملية التمثيل الغذائي ، والوظيفة الطبيعية للأوعية الدموية الدقيقة في الجدار الجانبي أمر بالغ الأهمية للحفاظ على إمكانات القوقعة الداخلية ، ونقل الأيونات ، وتوازن السوائل. تم الإبلاغ عن أشكال مختلفة من اضطرابات السمع تنطوي على دوران الأوعية الدقيقة غير الطبيعي في القوقعة. يعد التحقيق في كيفية تأثير أمراض تدفق الدم القوقعي (CoBF) على وظيفة السمع أمرا صعبا بسبب عدم وجود طرق استجواب مجدية وصعوبة الوصول إلى الأذن الداخلية. تم استخدام نافذة وعاء مفتوحة في جدار القوقعة الصناعية الجانبي ، جنبا إلى جنب مع المجهر الفلوري داخل الحيوية ، لدراسة تغيرات CoBF في الجسم الحي ، ولكن في الغالب في خنزير غينيا ومؤخرا فقط في الفأر. تصف هذه الورقة والفيديو المرتبط بها طريقة نافذة الأوعية المفتوحة لتصور تدفق الدم في قوقعة الفأر. وتشمل التفاصيل 1) إعداد تعليق خلايا الدم المسمى بالفلورسنت من الفئران. 2) بناء نافذة وعاء مفتوحة للفحص المجهري داخل الحيوية في فأر مخدر ، و 3) قياس سرعة تدفق الدم وحجمه باستخدام تسجيل غير متصل بالإنترنت للتصوير. يتم تقديم الطريقة في شكل فيديو لإظهار كيفية استخدام نهج النافذة المفتوحة في الماوس للتحقيق في التغيرات الهيكلية والوظيفية في دوران الأوعية الدقيقة للقوقعة الصناعية في ظل الظروف العادية والمرضية.
تعد الوظيفة الطبيعية لدوران الأوعية الدقيقة في جدار القوقعة الصناعية الجانبي (الذي يضم غالبية الشعيرات الدموية في الرباط الحلزوني والأوعية الدموية المخططة) مهمة للغاية للحفاظ على وظيفة السمع1. CoBF غير طبيعي متورط في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من اضطرابات الأذن الداخلية بما في ذلك فقدان السمع الناجم عن الضوضاء ، واستسقاء الأذن ، و presbycusis2،3،4،5،6،7،8،9. سيمكن تصور CoBF داخل الحيوية من فهم أفضل للروابط بين وظيفة السمع وأمراض الأوعية الدموية القوقعية.
على الرغم من أن تعقيد القوقعة وموقعها داخل العظم الصدغي يحول دون التصور المباشر وقياس CoBF ، فقد تم تطوير طرق مختلفة لتقييم CoBF بما في ذلك قياس تدفق الدوبلر بالليزر (LDF) 10،11،12 ، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) 13 ، المجهر الفلوري داخل الحيوية (FIVM) 14 ، التنظير المجهري الفلوري (FME) 15 ، التصوير بالأشعة بالليزر بالمنظار (LSCI)16 ، والنهج القائمة على حقن العلامات الموسومة والميكروسفير الموسوم إشعاعيا في مجرى الدم (تصوير الأوعية الدقيقة الضوئية، OMAG)17،18،19،20. ومع ذلك ، لم تمكن أي من هذه الطرق من التتبع المطلق في الوقت الفعلي للتغيرات في CoBF في الجسم الحي ، باستثناء FIVM. FIVM ، بالاقتران مع نافذة وعاء في جدار القوقعة الصناعية الجانبي ، هو نهج تم استخدامه والتحقق من صحته في خنزير غينيا في ظل ظروف تجريبية مختلفة من قبل مختبرات مختلفة14،21،22.
تم إنشاء طريقة FIVM بنجاح لدراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في دوران الأوعية الدقيقة القوقعة الصناعية في الفأر باستخدام فلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC)-dextran كوسط تباين وصبغة فلورية – إما DiO (3 ، 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate ، الأخضر) أو Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate ، red) – لوضع العلامات المسبقة على خلايا الدم ، وتصور الأوعية ، وتتبع سرعة تدفق الدم. في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول هذه الطريقة للتصوير وتحديد التغيرات في CoBF في الفئران في ظل الظروف العادية والمرضية (مثل بعد التعرض للضوضاء). تمنح هذه التقنية الباحث الأدوات اللازمة للتحقيق في الآليات الأساسية ل CoBF المتعلقة بضعف السمع وعلم الأمراض في الأوعية الدموية stria ، خاصة عند تطبيقها بالاقتران مع نماذج الفئران المعدلة وراثيا المتاحة بسهولة.
توضح هذه الورقة كيف يمكن تصور الشعيرات الدموية في الجدار الجانبي للقوقعة الصناعية (وفي ستريا والأوعية الدموية) لنموذج الفأر مع وضع العلامات الفلوروفورية في إعداد نافذة وعاء مفتوح تحت نظام FIVM. يستخدم نموذج الماوس على نطاق واسع ويفضل كنموذج للثدييات للتحقيق في صحة الإنسان ومرضه. البروتوكو?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا البحث من قبل NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi) ، NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi) ، NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) ، ومؤسسة البحوث الطبية من جامعة أوريغون للصحة والعلوم (OHSU) (X.Shi).
0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
PBS | Gibco | 2085387 | |
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |