Цель этого протокола заключается в доставке животных полученных и искусственных блюд крови комаров Aedes aegypti через искусственную мембрану подачи и точно количественно объем еды попадает.
Самки некоторых видов комаров могут распространять болезни, кусая позвоночных хозяев, чтобы получить богатые белком блюда крови, необходимые для развития яйцеклеток. В лаборатории исследователи могут доставлять комаров с помощью мембранных фидей, которые позволяют манипулировать составом пищи животного происхождения и искусственной крови. Здесь мы представляем методы кормления крови и искусственной крови комаров Aedes aegypti и количественного объема, потребляемого отдельными женщинами.
Целенаправленное кормление и количественная оценка искусственных/кровяных блюд широко используются, включая тестирование влияния компонентов питания на поведение комаров и физиологию, доставку фармакологических соединений без инъекций и заражение комаров конкретными патогенами. Добавление флуоресцентного красителя в пищу перед кормлением позволяет последующей количественной оценки размера еды. Объем еды, потребляемой комарами, может быть измерен либо по весу, если самки должны быть использованы позже для поведенческих экспериментов, или путем гомогенизации отдельных женщин в 96-хорошо пластин и измерения уровня флуоресценции с помощью считывателя пластин в качестве конечной точки анализа. Количественная оценка размера еды может быть использована для определения того, изменяет ли изменение компонентов еды объем приема пищи или потребление еды отличается между штаммами комаров. Точная количестве еды количественно также имеет решающее значение для вниз по течению анализы, такие, как те, измерения воздействия на принимающей притяжения или плодовитости. Методы, представленные здесь, могут быть дополнительно адаптированы для отслеживания пищеварения еды в течение нескольких дней или для включения нескольких различимых маркеров, добавленных в различные блюда (например, нектар и кровь) для количественной оценки потребления каждого приема пищи одним комаром.
Эти методы позволяют исследователям в одиночку выполнять измерения высокой пропускной способности для сравнения объема еды, потребляемой сотнями отдельных комаров. Поэтому эти инструменты будут в целом полезны для сообщества исследователей комаров для ответа на различные биологические вопросы.
Мы представляем протокол для кормления модифицированных блюд крови комаров Aedes aegypti с помощью искусственной мембранной подачи и точного измерения объема еды, потребляемой каждым отдельным комаром. Этот протокол может быть гибко адаптирован для изменения содержания еды или для сравнения объема еды, потребляемой различными экспериментальными группами комаров.
Комар Ae. aegypti угрожает глобальному здоровью, распространяя патогенные микроорганизмы, которые вызывают заболевания, включая желтую лихорадку, лихорадку денге, чикунгунья и вирус Зика1,2,3,4,5. Самки Ae. aegypti обязаны кровоскормы; они должны потреблять позвоночных крови, чтобы получить необходимый белок для развития яйцеклетки, и каждый сцепление яиц требует полной еды крови, по крайнеймере один хозяин 6,7,8. Самка комара сначала кусает хозяина, прокалывая кожу своим стилем и вводя слюну, которая содержит соединения, которые вызывают иммунный ответхозяина 9. Затем она питается, перекачивая кровь через ее stylet в ее midgut. Потребляя пищу крови от инфицированного хозяина, она может провести кровьпатогенов 6,8 , которые затеммигрируютиз комаров midgut к ее слюнных желез10. Самки комаров, инфицированных таким образом, могут распространять болезни путем инъекций патогенных микроорганизмов вместе со слюной приукусе последующих хозяев 11,12. Понимание и количественная оценка механизмов поведения при кормлении крови являются важнейшими шагами в борьбе с передачей болезней, передаваемых комарами.
Многие лабораторные протоколы для выращивания комаров и экспериментов использовать живых животных, включая мышей, морскихсвинок, или людейв качестве источника крови 13,14,15,16. Использование живых животных налагает этические проблемы, а также сложные требования к обучению персонала, жилью и уходу за животными, а также соблюдение политики Комитета по уходу и использованию животных (МАКУК). Он также ограничивает типы соединений, которые могут быть доставлены комаров, что ограничивает исследования, которые могут быть проведены17.
Искусственные аппараты для кормления крови, которые обычно используют мембранную систему для имитации кожи хозяина, являются полезными инструментами для изучения поведения при кормлении крови, которые обходят необходимость поддержания живых хозяев. Вся кровь может быть приобретена у ряда поставщиков и подается комарам с помощью подогревом, водяной курткой искусственных мембран фиделили аналогичных устройств 18,19. В этом протоколе мы демонстрируем использование небольших одноразовых мембранных фидерсов, которые называются «Глитрубы». Эта мембранная кормушка, ранее опубликованная Costa-da-Silva et al. (2013)20, может быть легко собрана из стандартного лабораторного оборудования, что делает ее идеальной для доставки крови к умеренному количеству комаров и простой для масштабирования для тестирования больших групп или нескольких формулировок еды. Glytube является недорогой и эффективной альтернативой другим коммерческим искусственных фидеров, которые могут потребовать больших объемов еды и более пригодны для партии кормления больших групп комаров на одинприем пищи формулировки 21.
Этот протокол включает в себя два раздела: подготовка/доставка искусственных блюд и количественная оценка потребления. В первом разделе, Glytubes используются в качестве эффективного средства для доставки манипулировать диеты. Вся кровь может быть заменена полностью искусственной едой, чтобы сравнить эффекты заменителей крови вместо еды крови. Рецепт адаптированы из Коган (1990)22 представлен здесь, хотя несколько искусственных формулировокеды были разработаны 23,24. Кроме того, кормление является менее инвазивным и менее трудоемким методом введения фармакологических соединений, чем инъекция. Из-за низкого общего объема, необходимого для каждого приема пищи (1-2 мл), этот протокол обеспечивает привлекательный метод доставки, чтобы уменьшить количество дорогих реагентов. Ae. aegypti женщины легко потребляют без белка питание солевого раствора с аденозином 5 “трифосфат(АТФ) 25,26, который обеспечивает базовый уровень для измерения воздействия отдельных компонентов еды. Например, Нейропептид Y-как рецептор 7 (NPYLR7) в Ae. aegypti, как известно, посредником принимающей ищет подавления после богатых белком крови еды, и когда NPYLR7 агонисты добавляются в безбелковый солевой еды, самки комаров экспонат принимающей поисках подавления похож на те, которыепотребляли всю кровь 7.
Во втором разделе представлены шаги по количественной оценке объема каждого приема пищи, потребляемого отдельными самками комаров. Этот анализ основан на флуоресценции и фиксирует состояние кормления в более высоком разрешении, чем методы, в которых женщины классифицируются как “кормили” или “unfed” на основе визуальной оценки брюшной дистензии в одиночку. Добавляя флуоресцентный к трапезе до кормления, объемы еды, проглатываемые отдельными лицами, могут быть количественно определены путем гомогенизации каждого комара в 96-хорошо пластины и измерения интенсивности флуоресценции в качестве считывания. Этот анализ может измерять различия в энергии кормления в ответ на такие переменные, как состав еды или генетический фон комаров. Точная количественная оценка имеет решающее значение для промежуточных размеров еды, например, когда женщинам предлагаются неоптимальные блюда, содержащие сдерживающие факторы для кормления, или когда они потребляют сахарозные блюдапеременных размеров 27. Если подкормленные комары необходимы для последующих поведенческих анализов после количественной оценки размера еды, размер еды может быть рассчитан путем взвешивания анестезированная самка в группах и оценки средней увеличенной массы на человека. Хотя менее точны, чем флуорессейн маркировки, взвешивание по-прежнему обеспечивает агрегированную оценку объема еды и позволяет изучать влияние еды на процессы вниз по течению, такие как плодовитость или последующего притяжения хозяина. В то время как размер еды крови является переменной и может зависетьот множества факторов 11,28,29 , попадаетразмеры едыизмеряется с методами, описанными здесь в соответствии спредыдущими количественными 7,30,31.
Для многих лабораторных применений, искусственные мембранные фидееры предлагают различные преимущества по сравнению с живыми хозяевами, позволяя исследователям возможность непосредственно манипулировать содержанием еды. Хотя несколько методов доступны для искусственного мембранного кормления, метод, описанный здесь предлагает преимущества в гибкости, стоимости и пропускной способности. По сравнению с другими коммерческими мембранными кормушками, анализ Glytube требует небольшого объема еды, что делает его эффективным механизмом доставки дорогостоящих реагентов, включая лекарства или патогенные микроорганизмы, путем минимизации общего объема,необходимого 7,35. По мере того как и протеин-свободно солевой и искусственная еда крови способствуют engorgement, соединения или патогены можно добавить к любой еде как high-throughput и неинвазивная алтернатива к инъекциям. Кроме того, каждый компонент Glytube можно легко мыть, заменять или масштабировать для доставки и количественной оценки нескольких типов еды без перекрестного загрязнения аппарата питания.
Для количественной оценки объемов еды, потребляемой комарами, метод на основе флуоресценции позволяет более точно определить размер еды, чем взвешивание комаров до и после кормления. Следует отметить, что данный метод является анализом конечных токов. В отличие от этого, взвешивание позволяет комаров, чтобы сохранить в живых для дальнейших экспериментов. С помощью считывателя пластин метод на основе флуоресценции может быть легко расширен для высокой пропускной способности количественной оценки блюд, потребляемых сотнями отдельных женщин.
Для достижения высоких показателей кормления, сочетание достаточного принимающей сигналы должны присутствовать, чтобы активировать женский принимающей поведение и привлечь женщин к кормушки. Если комары не скучены под Glytube, еда не может быть должным образом нагревается, или CO2 доставка не может быть достаточно. Добавление человеческого запаха к поверхности мембраны надежно повышает привлекательность искусственной мембраны. Если комары наблюдаются под Glytube, но не в состоянии кормить, состав еды может быть виноват. Самки не могут кормить, если сама еда не теплая, кровь слишком старая, или если добавки к трапезе по своей сути аверсивны или вызывают нежелательнуюхимическую реакцию 36. Дополнительный АТФ также надежно увеличивает показатели кормления и может быть увеличен до конечной концентрации 2 мМ в каждом из предусмотренных рецептов. Самки не могут кормить, если парафильм не вытащил тугой через крышку Glytube; парафильм должен быть равномерно прозрачным и не должен пряжки, так как это предотвращает женщину от возможности эффективно проколоть parafilm с ее stylet. Если еда протекает через Glytube на сетку, парафильм может быть разорван во время процесса растяжения и должен быть заменен.
Изменение состава еды также может позволить исследователям манипулировать продолжительностью времени, необходимого для очищения еды от midgut, а также последующим поведением, ищущим хозяина. Блюда, представленные здесь требуют 24-36 ч дляпищеварения 7 похож на животных полученных крови. После кормления на любой из этих приемов пищи, женщины будут подавлять хост-поиск во время пищеварения время окна. Так как солевой еды не хватает белка, женщины возвращаются к хозяину ищет после еды очищается. Если более быстрое возвращение желательно, исследователи могут выбрать альтернативные “быстрой очистки” солевые блюда, которые выделяются примерно в 6 ч27. В то время как состав солевой муки, представленной здесь, сравнивается с результатами искусственной крови, «быстрая очистка» еды более тесно соответствует физиологическим уровням соли, обнаруженным в крови позвоночных.
Методы, описанные здесь, имеют ограничения, которые следует рассмотреть, прежде чем выбрать анализ, который наиболее подходит для экспериментальных целей исследователя. Описанные измерения флуоресцента не позволяют снова использовать комаров для дополнительных экспериментов. Тем не менее, измерения веса могут быть приняты до количественной оценки размера еды с использованием флуоресксейна анализа. Если вес и размер еды являются последовательными в нескольких испытаниях для данного приема пищи, вес может быть использован в качестве прокси в будущих экспериментах. Кроме того, в этом протоколе не проводится различия между дефицитом в поиске хозяина и поведением, питающиеся кровью; комары, которые показывают нарушения в поиске мембраны подачи будет иметь снижение уровня кормления и / или размер еды. Добавив камеру для записи поведения на протяжении всего анализа, исследователи могут определить, не могут ли самки найти Glytube, или же они находят Glytube, но не питаются.
Анализ, описанный здесь, может быть адаптирован для изучения многих нерешенных вопросов, связанных с поведением кормления у комаров. Например, вклад конкретных белков крови можно исследовать путем изменения соотношения составных белков или общей концентрации белка в искусственной крови. Для оценки размеров еды из нескольких событий кормления, красители с различными спектрами флуоресценции могут быть добавлены, чтобы отличить питание от уникальныхисточников 37. Этот протокол также может быть изменен, чтобы отдельно стимулировать внутренние ротовые части, которые обнаруживают кровь и которые используются для приема внутрь (т.е. stylet), и хемосенсорные придатки, которые контактируют с кожей (т.е. лабий, ноги), как комар земли, чтобы начатькормление крови 36. Например, если лиганды добавляются непосредственно в трапезу, они не контактировать с лабием и ногами, так как мембрана пронзается только stylet. Если лиганды добавляются на внешнюю поверхность парафильма вместо этого, они остаются отделенными от еды и могут связаться с лабием иногами 36. Наконец, подробные кинетики крови кормления поведение не очень хорошо изучены и метод, представленный здесь может быть изменен, чтобы объединить высокое разрешение отслеживания с машинным обучением инструменты для извлечения поведенческих считывания передвижения, осанки и кормлениядинамики 38.
Этот протокол направлен на то, чтобы быть удобным и экономически эффективным, с возможностью служить исследователям, использующим фармакологические и генетические манипуляции для изучения комаров, кормящих кровью и после кормления крови поведения.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Нипуна Басрера, Адриану К. Росас Вильегас, Надава Шай и Тревора Сорреллса за комментарии к рукописям, а Чжуньяна Гонга и Киролоса Барсума — за техническую помощь. Мы благодарим Алекса Уайлда за фотографии, использованные на рисунке 1. К.В. был поддержан стипендией Boehringer Ingelheim Fonds PhD. В.Я. частично поддержал NIH T32-MH095246. Эта работа была частично поддержана грантом Рокфеллеровского университета от Медицинского института Говарда Хьюза через стипендию Джеймса Х. Гиллиама для программы Advanced Study для V.J. Данный материал основан на работе, поддерживаемой Программой стипендий Национального научного фонда в рамках гранта No. NSF DGE-1325261 до В.Я. Любые мнения, выводы и выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, являются мнениями автора (ы) и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда.
15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
Laboratory wrapping film – parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
Rubber bands | |||
Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
Vortex mixer | |||
Water bath | Alternate heating device may be used | ||
White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |