Neste relato apresentamos um protocolo que permite ao investigador gerar um modelo de uveíte intraocular em camundongo. Mais comumente referido como uveíte autoimune experimental (EAU), este modelo estabelecido captura muitos aspectos da doença humana. Aqui, descreveremos como induzir e monitorar a progressão da doença usando várias leituras.
A Uveíte Autoimune Experimental (EAU) é impulsionada por células imunes que respondem a autoantígenos. Muitas características deste modelo de doença inflamatória intraocular não infecciosa recapitulam o fenótipo clínico da uveíte posterior que afeta humanos. A EAU tem sido usada de forma confiável para estudar a eficácia de novas terapias inflamatórias, seu modo de ação e para investigar melhor os mecanismos que sustentam a progressão da doença de distúrbios intraoculares. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado sobre a indução de EAU no camundongo C57BL/6J – o organismo modelo mais utilizado com suscetibilidade a esta doença. A avaliação clínica da gravidade e progressão da doença será demonstrada por meio de fundoscopia, exame histológico e angiografia fluoresceína. O procedimento de indução envolve a injeção subcutânea de uma emulsão contendo um peptídeo (IRBP1-20) da proteína ocular interfotorreceptor retinóide proteína (também conhecida como proteína de ligação ao retinol 3), Adjuvante de Freund Completo (CFA) e suplementado com Mycobacterium tuberculosis morto. A injeção desta emulsão viscosa na parte de trás do pescoço é seguida por uma única injeção intraperitoneal de toxina Bordetella pertussis . No início dos sintomas (dia 12-14) e sob anestesia geral, são obtidas imagens fundoscópicas para avaliar a progressão da doença através do exame clínico. Esses dados podem ser comparados diretamente com aqueles em momentos posteriores e pico de doença (dia 20-22) com diferenças analisadas. Ao mesmo tempo, este protocolo permite que o investigador avalie possíveis diferenças na permeabilidade e dano dos vasos usando angiografia fluoresceína. A EAU pode ser induzida em outras cepas de camundongos – tanto selvagens quanto geneticamente modificadas – e combinada com novas terapias que oferecem flexibilidade para estudar a eficácia de medicamentos e/ou mecanismos de doenças.
Este protocolo demonstrará como induzir a Uveíte Autoimune Experimental (EAU) em camundongos C57BL/6J por uma única injeção subcutânea de um antígeno da retina em um adjuvante emulsionado. Os métodos para monitorar e avaliar a progressão da doença serão detalhados por meio de imagens fundoscópicas e exame histológico, com parâmetros de medição delineados dentro. Além disso, a angiografia fluoresceína, uma técnica para examinar a estrutura e a permeabilidade dos vasos sanguíneos da retina, será discutida.
Este modelo EAU recapitula as características centrais da uveíte posterior não infecciosa em humanos no que diz respeito às características clínico-patológicas e aos mecanismos celulares e moleculares básicos que impulsionam a doença. A EAU é mediada por subconjuntos Th1 e/ou Th17 de linfócitos CD4+T auto-reativos, como demonstrado em experimentos de transferência adotiva e com camundongos empobrecidos de IFNγ1. Grande parte da nossa compreensão dos papéis potenciais para essas células na uveíte vem do estudo da EAU2, onde as células Th1 e Th17 são detectadas nos tecidos da retina3. Muitas vezes, a EAU é usada como um modelo pré-clínico para avaliar a utilidade de novas terapias na atenuação da doença. Abordagens terapêuticas que modularam com sucesso a doença EAU mostraram alguma eficácia na clínica e atingiram o status de aprovação da FDA. Exemplos disso são grupos de drogas imunorreguladoras, como as terapias direcionadas às células T: ciclosporina, FK-506 e rapamicina 4,5,6. Recentemente, intervenções direcionadas a novas vias também foram exploradas neste modelo para investigar o mecanismo e o efeito no desfecho da doença. Estes incluem o direcionamento da regulação transcricional através de proteínas Bromodomain Extra-Terminal (BET) leitoras de cromatina e inibidores de P-TEFb3. Além disso, abordagens mais convencionais, como um inibidor de VLA-4, demonstraram recentemente supressão na EAU via modulação de células T CD4+ efetoras7. Além disso, a segmentação de células Th17 com TMP778, um agonista inverso RORγt, também foi encontrada para suprimir significativamente EAU8. Além disso, este modelo oferece uma oportunidade para estudar a inflamação autoimune crônica na retina e os mecanismos subjacentes que o acompanham, como o priming de linfócitos.
As leituras primárias para estudos pré-clínicos de EAU são a avaliação clínica por meio da realização de imagens de fundoscopia da retina e, com menor frequência, pela avaliação da integridade da retina por Tomografia de Coerência Óptica (OCT). A avaliação histopatológica da retina e a imunofenotipagem das células da retina por citometria de fluxo são então realizadas no término. A fundoscopia é um sistema de imagem ao vivo fácil de usar que permite uma avaliação clínica rápida e reprodutível de toda a retina. Para as avaliações imuno-histoquímicas, as técnicas baseiam-se na preparação de cortes da retina que permitem estudar a arquitetura tecidual quanto ao grau de inflamação e dano estrutural9. Os critérios de avaliação e os sistemas convencionais de pontuação, para todas as técnicas utilizadas, serão descritos neste protocolo. A extensão do dano registrado usando imagens fundoscópicas geralmente se correlaciona estreitamente com alterações histológicas. Essa abordagem dupla para monitorar e avaliar a gravidade da doença proporciona maior sensibilidade e resultados de medição mais confiáveis.
A EAU é um modelo bem estabelecido e comumente usado para testes pré-clínicos e investigação de doenças oculares imunomediadas. Esse modelo é confiável e reprodutível com incidência de doença de >95% e gera dados abrangentes que podem ser utilizados para validar ou repudiar novas terapias para o tratamento da doença inflamatória intraocular que representa uma das principais causas de cegueira em idade ativa em todo o mundo10.
Modelos animais experimentais são ferramentas necessárias para o estudo da patogênese da doença e testes pré-clínicos de novos paradigmas terapêuticos. No protocolo atual, discutimos uma metodologia para induzir, monitorar e pontuar EAU, um modelo experimental de uveíte inflamatória intraocular. Esse modelo de EAU tem mais de 95% de incidência da doença quando todos os procedimentos são realizados de acordo com o protocolo aqui descrito, e resulta no desenvolvimento de EAU crônica e monofásica. Para atingir…
The authors have nothing to disclose.
JG foi premiado com um financiamento UCL Impact Studentship e Rosetrees Trust para apoiar o CB. VC recebeu uma bolsa colaborativa de pesquisa da Akari Therapeutics Inc. Gostaríamos de agradecer ao Instituto de Oftalmologia da UCL, Unidade de Serviço Biológico, especialmente à Sra. Alison O’Hara e sua equipe por seu apoio técnico.
antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |