O nematode geneticamente tratável Caenorhabditis elegans pode ser usado como um modelo simples e barato para a descoberta de drogas. Descrito aqui é um protocolo para identificar terapêutica anticancerígenas que inibem a sinalização a jusante das proteínas RAS e EGFR.
As alterações na localização da membrana plasmática do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e seu efeito a jusante RAS foram implicadas em várias doenças, incluindo o câncer. O nematode de vida livre C. elegans possui uma cascata de sinal map EGFR-RAS-ERK evolutiva e funcionalmente conservada que é central para o desenvolvimento da vulva. O ganho de mutações de função no homólogo RAS LET-60 e EGFR homólogo LET-23 induzem a geração de pseudovulva ectópica não-funcional visível ao longo da parede do corpo ventral desses vermes. Anteriormente, o fenótipo multivulval (Muv) nesses vermes tem se mostrado inibido por pequenas moléculas químicas. Aqui descrevemos um protocolo para o uso do worm em um ensaio à base de líquido para identificar inibidores que abolim as atividades das proteínas EGFR e RAS. Usando este ensaio, mostramos R-fendiline, um inibidor indireto de K-RAS, suprime o fenótipo Muv expresso nos vermes mutantes let-60(n1046) e let-23(sa62). O ensaio é simples, barato, não é demorado para a configuração, e pode ser usado como uma plataforma inicial para a descoberta de terapêutica anticancerígena.
As vias celulares que regulam eventos de desenvolvimento dentro dos organismos são altamente conservadas entre todos os metazoanos. Um desses caminhos é a cascata de sinalização de proteína ativada por mitogênio EGFR-RAS-ERK (MAPK), que é um caminho crítico que rege a proliferação celular, diferenciação, migração e sobrevivência1,2. Defeitos nessa via de sinalização podem levar a estados patológicos ou de doenças, como o câncer. O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) mostrou-se altamente expresso em tumores humanos, incluindo 50% dos carcinomas escamosos escamosos orais, e contribui para o desenvolvimento de tumores malignos3,4,5. Considerando que as mutações nos três ISoformes RAS H-, K-e N-RAS são os principais impulsionadores da transformação maligna em múltiplos cânceres humanos. Entre esses três isoformes RAS, as mutações oncogênicas em K-RAS são as mais prevalentes6,7,8. Para que o EGFR e o RAS funcionem, eles devem se localizar na membrana plasmática (PM). Prevenir a localização dessas moléculas para a PM pode revogar completamente a atividade biológica desta via de sinal9,10. Daí a inibição da localização dessas proteínas para a PM é uma estratégia terapêutica para bloquear a sinalização a jusante e os desfechos adversos resultantes. Usando um ensaio de triagem de alto teor, fendiline, um bloqueador de canal de cálcio tipo L, foi identificado como um inibidor da atividade K-RAS11. A nanoglomeragem de K-RAS ao folheto interno da PM é significativamente reduzida na presença de fendilina. Além disso, o K-RAS é redistribuído da membrana plasmática para o ânticulo endoplasmático (ER), aparelho golgi, endosários e citosol. Mais importante, a proliferação de linhas de células cancerígenas pancreáticas, cólons, pulmonares e endometrial expressando o mutante oncogênico K-RAS é bloqueada pela inibição da sinalização a jusante pela fendiline11. Esses dados sugerem funções de fendilina como um terapêutico anticâncer K-RAS específico que causa a má localização da proteína RAS ao PM.
O nematode Caenorhabditis elegans tem sido extensivamente estudado no contexto do desenvolvimento. Muitas das vias de sinal que governam o desenvolvimento do verme são evolutivas e funcionalmente conservadas. Por exemplo, a ativação mediada pelo EGFR do RAS e a ativação subsequente da cascata de sinal ERK MAPK são conservadas no worm12. A cascata é representada pelas seguintes proteínas: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. Let-60 é homólogo do RAS, enquanto o LET-23 é homólogo do EGFR. No verme, essa via regula o desenvolvimento da vulva13. A vulva é uma abertura epitelial na parede do corpo ventral do verme que permite que ovos fertilizados sejam colocados. A formação da vulva no verme depende da exposição das células precursoras vulval (VPC) a um gradiente de ativação da cascata de sinal EGFR-RAS-MAPK. Durante o desenvolvimento normal, os VPCs proximais recebem fortes sinais das células de ancoragem gonadal para se diferenciar em destinos de células 1° e 2° que dão origem a uma vulvafuncional 12. Considerando que os VPCs distal se diferenciam em destinos de células 3° que se fundem ao siníntécio hipodérmico e não formam vulva devido à sinalização esgotada. Na ausência de sinalização, todas as VPCs se diferenciam em destinos celulares 3° resultando na formação de nenhuma vulva. No entanto, a sinalização constitutiva leva à formação de uma ou mais vulva não funcionais devido à indução de todos os VPCs para assumir destinos celulares de 1° e 2°.
Mutações que causam indução vulval defeituosa ou excessiva foram identificadas para muitos dos genes que codificam proteínas que representam esse caminho. A indução vulval defeituosa resulta em um fenótipo vulvaless (Vul), enquanto a indução excessiva de vulval resulta em um fenótipo multivulva (Muv) que é representado pelo desenvolvimento de numerosos pseudovulvaos ectópicos não funcionais em toda a parede do corpo ventral. O fenótipo Muv expresso pela cepa let-60(n1046) é devido a um ganho de mutação de função no RAS, enquanto na cepa let-23(sa62) é devido a uma mutação ativadora no EGFR14,15. O forte fenótipo Muv nestas cepas mutantes tem se mostrado perturbado por intervenções farmacológicas como demonstrado pelo tratamento de vermes let-60(n1046) com o inibidor MEK-1 U012616,17. Curiosamente, mostramos que r-fendilina e inibidores que afetam o metabolismo de sphingomyelin suprimem o fenótipo Muv no verme18. Para demonstrar esses inibidores bloqueiam a sinalização let-60 ao nível do RAS, utilizou-se a cepa nula lin-1 17. Lin-1 é um fator de transcrição inibitória semelhante ao Ets que funciona como um repressor no desenvolvimento da vulva19. Forte reversão do fenótipo Muv em worms let-60(n1046) e nenhum efeito sobre vermes nulos lin-1 sugerem que essas inibições ocorrem ao nível de RAS.
Neste protocolo, demonstramos o uso de C. elegans como modelo para identificar inibidores de proteínas RAS e EGFR. Usando um ensaio à base de líquido, demonstramos os efeitos inibitórios da R-fendiline suprimindo os fenótipos Muv nas cepas mutantes let-60(n1046) e let-23(sa62) de C. elegans. Este ensaio valida o uso de C. elegans como uma ferramenta na fase inicial de descoberta de medicamentos para terapêutica anticancerígena.
Os ensaios que descrevemos usando o worm são simples e baratos para identificar inibidores da função EGFR e RAS. C. elegans é um modelo atraente para a descoberta de drogas porque é fácil crescer em laboratório devido ao ciclo de vida curto (3 dias a 20 °C) e à capacidade de gerar um grande número de larvas. Mais importante, a via MAPK EGFR-RAS-ERK é evolutiva e funcionalmente conservada com mamíferos fornecendo um sistema geneticamente tratável para analisar os efeitos dos inibidores EGFR e RAS. Al…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) por fornecer o let-60(n1046). Agradecemos também ao Dr. David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology em Houston) pela cepa lin-1. Por fim, agradecemos à Dra. Algumas cepas de vermes foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto de Prevenção e Pesquisa do Câncer do Texas (CPRIT) conceder RP200047 à JF Hancock.
Media and chemicals | |||
Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
(−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
Consumables | |||
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
Software | |||
Prism | Graphpad | ||
Bacterial Strains | |||
E. coli OP50 | |||
Worm Strains | |||
Strain | Genotype | Transgene | Source |
MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |