Flux de travail complet de protéomique des échantillons de tissus basée sur la spectrométrie de masse
Summary
Le protocole décrit fournit une analyse protéomique quantitative optimisée des échantillons de tissus à l’aide de deux approches : la quantification basée sur l’étiquette et la quantification sans étiquette. Les approches basées sur l’étiquette ont l’avantage d’une quantification plus précise des protéines, tandis qu’une approche sans étiquette est plus rentable et utilisée pour analyser des centaines d’échantillons d’une cohorte.
Abstract
Les progrès récents de la spectrométrie de masse ont abouti à une analyse protéomique approfondie ainsi qu’à la génération d’ensembles de données robustes et reproductibles. Cependant, malgré les progrès techniques considérables, la préparation d’échantillons à partir d’échantillons biologiques tels que le sang des patients, le LCR et les tissus pose encore des défis considérables. Pour identifier les biomarqueurs, la protéomique tissulaire fournit souvent une source d’échantillon attrayante pour traduire les résultats de la recherche du laboratoire à la clinique. Il peut révéler des biomarqueurs potentiels candidats pour le diagnostic précoce du cancer et des maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, etc. La protéomique tissulaire produit également une mine d’informations systémiques basées sur l’abondance des protéines et aide à répondre à des questions biologiques intéressantes.
L’analyse protéomique quantitative peut être regroupée en deux grandes catégories : une approche basée sur l’étiquette et une approche sans étiquette. Dans l’approche basée sur l’étiquette, les protéines ou les peptides sont marqués à l’aide d’isotopes stables tels que SILAC (marquage isotopique stable avec des acides aminés en culture cellulaire) ou par des marqueurs chimiques tels que ICAT (marqueurs d’affinité codés isotopiques), TMT (marqueur de masse tandem) ou iTRAQ (marqueur isobare pour la quantification relative et absolue). Les approches basées sur l’étiquette ont l’avantage d’une quantification plus précise des protéines et en utilisant des étiquettes isobares, plusieurs échantillons peuvent être analysés en une seule expérience. L’approche sans étiquette offre une alternative rentable aux approches basées sur l’étiquette. Des centaines d’échantillons de patients appartenant à une cohorte particulière peuvent être analysés et comparés à d’autres cohortes en fonction des caractéristiques cliniques. Ici, nous avons décrit un flux de travail protéomique quantitatif optimisé pour les échantillons de tissus à l’aide de méthodes de profilage du protéome sans étiquette et basées sur l’étiquette, ce qui est crucial pour les applications dans les sciences de la vie, en particulier les projets basés sur la découverte de biomarqueurs.
Introduction
Les technologies protéomiques ont le potentiel de permettre l’identification et la quantification de marqueurs candidats potentiels qui peuvent aider à la détection et au pronostic de la maladie1. Les progrès récents dans le domaine de la spectrométrie de masse ont accéléré la recherche clinique au niveau des protéines. Les chercheurs tentent de relever le défi de la pathobiologie compliquée de plusieurs maladies en utilisant la protéomique basée sur la spectrométrie de masse, qui offre maintenant une sensibilité accrue pour l’identification et la quantification des protéines2. Une mesure quantitative précise des protéines est cruciale pour comprendre la coopération dynamique et spatiale entre les protéines chez les individus sains et malades3; cependant, une telle analyse à l’échelle du protéome n’est pas facile.
L’une des principales limites du profilage protéomique des échantillons cliniques est la complexité des échantillons biologiques. De nombreux types d’échantillons différents ont été étudiés pour étudier le protéome de la maladie, tels que les lignées cellulaires, le plasma et les tissus4,5. Les lignées cellulaires sont largement utilisées comme modèles dans des expériences in vitro pour imiter différents stades de la progression de la maladie. Cependant, une limitation majeure avec les lignées cellulaires est qu’elles acquièrent facilement des changements génotypiques et phénotypiques au cours du processus de culture cellulaire6. Les fluides corporels tels que le plasma pourraient être une source attrayante pour la découverte de biomarqueurs; cependant, en raison de la forte abondance des protéines et de la plage dynamique de concentration en protéines, la protéomique plasmatique est un peu plus difficile7. Ici, les peptides issus des protéines les plus abondantes peuvent supprimer celles dérivées des protéines peu abondantes même si le rapport masse/charge est le même6. Bien qu’il y ait eu des progrès dans les technologies d’épuisement et de fractionnement au cours des dernières années, obtenir une bonne couverture reste une limitation majeure de la protéomiqueplasmatique 8,9. L’utilisation de tissus pour l’investigation protéomique de la biologie de la maladie est préférée car les échantillons de tissus sont les plus proches des sites de la maladie et offrent des informations physiologiques et pathologiques élevées pour fournir de meilleures informations sur la biologie de la maladie10,11.
Dans ce manuscrit, nous avons fourni un protocole simplifié pour la protéomique quantitative des échantillons de tissus. Nous avons utilisé un tampon contenant de l’urée de 8 M pour la préparation du lysate tissulaire car ce tampon est compatible avec les investigations basées sur la spectrométrie de masse. Cependant, il est obligatoire de nettoyer les peptides pour éliminer les sels avant de les injecter dans le spectromètre de masse. Un point important à retenir est de réduire la concentration d’urée à moins de 1 M avant d’ajouter de la trypsine pour la digestion des protéines, car la trypsine présente une faible activité à une concentration d’urée de 8 M. Nous avons expliqué deux approches de la protéomique globale quantitative : la quantification basée sur l’étiquette à l’aide d’iTRAQ (étiquettes isobares pour la quantification relative et absolue) et la quantification sans étiquette (LFQ). La protéomique quantitative basée sur l’iTRAQ est principalement utilisée pour comparer plusieurs échantillons dont l’état biologique varie (p. ex., échantillons normaux par rapport à la maladie ou traités). L’approche utilise des réactifs isobares pour étiqueter les amines primaires N-terminales des peptides12. Les réactifs iTRAQ contiennent un groupe rapporteur N-méthyl pipérazine, un groupe équilibreur et un groupe ester N-hydroxy succinimide qui réagit avec les amines primaires N-terminales des peptides13. Les peptides digérés de chaque condition sont marqués avec un réactif iTRAQ particulier. Après le profilage, la réaction est arrêtée et les peptides marqués de différentes conditions sont regroupés dans un seul tube. Ce mélange d’échantillons combinés est analysé par spectromètre de masse pour identification et quantification. Après l’analyse MS/MS, des fragments d’ions rapporteurs de faible masse moléculaire sont générés et les intensités ioniques de ces ions rapporteurs sont utilisées pour la quantification des protéines.
Une autre approche, la quantification sans étiquette, est utilisée pour déterminer le nombre relatif de protéines dans des échantillons complexes sans étiqueter les peptides avec des isotopes stables.
Protocol
Representative Results
Discussion
La protéomique tissulaire des échantillons biologiques nous permet d’explorer de nouveaux biomarqueurs potentiels associés à différents stades de progression de la maladie. Il explique également le mécanisme de signalisation et les voies associées à la progression de la maladie. Le protocole décrit pour l’analyse protéomique quantitative des tissus fournit de bonnes données de couverture reproductibles. La plupart des étapes ont été adaptées des instructions du fabricant. Afin d’obtenir des données…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le projet MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projet #34_IITB à SS et MASSFIITB Facility à IIT Bombay soutenu par le Département de biotechnologie (BT / PR13114 / INF / 22/206/ 2015) pour mener à bien toutes les expériences liées à la SEP.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
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