쥐의 골격 근육에서 섬유 선화 (FAP) 및 근생 전구자 (의원)의 식별, 격리 및 특성화
Summary
이 프로토콜은 쥐 골격 근에서 섬유-선화 선조 (FAP) 및 근생 선조 (의원)를 격리하는 방법을 설명합니다. 근육 상해 모형에 있는 쥐의 활용은 분석을 위한 위축근에서 증가한 조직 가용성및 자유로운 움직이는 동물에 있는 근육 강도 및 걸음걸이를 평가하기 위하여 검증된 방법의 더 큰 레퍼토리를 제공합니다.
Abstract
섬유-adipogenic 전조자 (FAP) 골격 근육에 거주 성 간질 세포, myogenic 전조와 함께 (의원), 근육 항상성에 중요 한 역할을, 부상, 그리고 수리. FAP 식별 및 절연 사용에 대한 현재 프로토콜은 혈류 세포측정제/형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 현재까지 생체내에서 의 기능을 평가하는 연구가 마우스에서만 수행되고 있다. 쥐의 더 큰 내재 크기는 골격 근육 부상 모델, 특히 가혹하게 위축성 근육또는 조사관이 여러 다운스트림 분석을 수행하기 위해 상당한 조직 질량을 필요로 할 때 FAP의 보다 포괄적 인 분석을 할 수 있습니다. 쥐는 또한 동물 진정 또는 희생을 필요로하지 않는 근육 기능적 인 연구의 더 큰 선택을 제공하므로 직렬 평가를 가능하게하여 이환율과 동물 사용을 최소화합니다. 마우스에 최적화된 유동 세포종/FACS 프로토콜은 종특이적이며, 특히 시판되는 항체의 특성에 의해 제한됩니다. 그(것)들은 쥐 또는 높게 섬유질 근육에서 FAP를 분리하기 위해 최적화되지 않았습니다. 표면 마커 CD31, CD45, Sca-1 및 VCAM-1의 차동 발현에 의존하여 건강하고 기질이 강한 쥐 골격 근육에서 FAP 및 MP의 식별 및 격리를 위한 유동 세포계/FACS 프로토콜이 개발되었다. 쥐 특이적, 유동 세포측정-검증된 1차 항체는 심각하게 제한되고, Sca-1을 표적으로 하는 항체의 사내 융합이 수행되었다. 이 프로토콜을 사용하여 성공적인 Sca-1 연상이 확인되었으며, FAP와 의원의 흐름 세포 식별은 FACS 격리 FAP 및 의원의 세포 배양 및 면역 스테인링에 의해 검증되었습니다. 마지막으로, 우리는 장기간 (14 주) 쥐 기종 모델에서 새로운 FAP 시간 과정을보고합니다. 이 방법은 조사자에게 새로운 동물 모델에서 FAP를 연구할 수 있는 기능을 제공합니다.
Introduction
섬유-adipogenic 전구 세포 (FAP)는 근육 항상성, 수리 및 재생에 중요한 역할을 하는 골격 근육에 거주하는 다능성 전구 세포의 인구이며, 반대로 근육 손상에 대한 병리학적 반응을 중재합니다. 이름에서 알 수 있듯이, FAP는 원래 섬유 아세포와 지방 세포1로 분화 할 수있는 잠재력을 가진 선조 인구로 확인되었으며 만성 상해 및 질병에 있는 골격 근육의 섬유 지방 침투의 핵심 중재자로 사칭되었습니다. 추가 연구 결과는 FAP가 골발생및 연골발생2,3,4의추가능력이 있다는 것을 밝혔다. 따라서, 그들은 더 광범위하게 중간 엽 또는 기질 선조로 문학에서 통보3,5,6,7,8. 급성 골격 근육 부상에서, FAP는 일시적으로 활성화 된 근육 위성 세포와 그들의 다운스트림 심근 선조 (의원)에 대한 유리한 환경을 제공하기 위해 일시적으로 증식하여 재생 근신생에 간접적으로 원조1,9,10. 성공적인 재생과 병행하여 FAP는 자멸을 겪으며 숫자를 기준 수준1,9,10,11로되돌린다. 대조적으로, 만성 근육 상해에서, FAP는 그들의 지속성9,10,11 및 이상한 근육 복구 결과 프로 세포 신호를 재정의합니다.
FAP가 근육 반응을 중재하는 세포 및 분자 메커니즘을 평가하는 생체 내 연구에서 현재까지뮤뇨 동물모델을1,7,9,10,11,12, 13,14로활용하였다. 유전자 조작 된 마우스는 이러한 분석에 사용하기위한 강력한 도구이지만, 동물의 작은 크기는 근육 위축이 외상성 기형과 같은 심오할 수있는 장기 국화 부상 모델에서 연구를위한 조직 가용성을 제한합니다. 더욱이, 근육강도 및 신체 기능의 측정은 마우스의 종료를 필요로 하는 전 생체 내 또는 시투 측정, 또는 수술 및/또는 전신 마취가 필요한 생체 내 측정을 필요로 하여 근육 수축 성능15,16,17,18,19,20의 평가를 허용해야합니다. . 쥐에서, 잘 검증되고 세계적으로 활용된 근육 기능 분석, 걸음걸이 분석(예를 들어, 상시 기능 지수, CatWalk 분석)과 같은 보다 복잡한 모터 행동에 대한 분석이 존재하며, 깨어 있고 자발적으로 움직이는 동물21,22,23,24에서 수행된다. . 이것은 또한 동물 실험에 있는 최소한의 이환율의 원리및 사용된 연구 동물의 수를 낙관합니다. 따라서 쥐는 FAP 조사관에게 단백질 및 세포 분석을 위한 더 큰 부상된 근육 부피의 추가된 융통성과 경보 동물에서 근육 복잡한 정적 및 동적 기능 활동 및 행동의 연쇄 평가를 착수하는 기능을 제공합니다.
FAP는 주로 유동 세포측정및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 전체 근육 샘플에서 각각 확인되고 격리되었습니다. 이들은 크기, 세분성 및 세포 표면 또는 세포 내마커(25)의특정 조합과 같은 특징적인 특징에 기초하여 다중 특정 세포 집단을 식별할 수 있는 레이저 기반 의 소세이다. 이것은 항상성 및 재생이 세포 모형의 과다에 의해 조정된 다자간 프로세스이기 때문에, 골격 근육과 같은 기관 시스템의 연구 결과에서 매우 유리합니다. 정액 연구는 마우스 골격 근육 1에서 유동 세포 측정 방법을 사용하여 FAP뿐만 아니라 의원을확인했습니다. 그(것)들은 내피성 (CD31), 조혈 (CD45), 또는 근생성 (Integrin-α7 [ITGA7]) 기원에서 세포에 특정표면 항원이 부족하기 때문에 FAP는 본질적으로 중간엽이다는 것을 보여주었습니다, 그러나 중간엽 줄기 세포 마커 Sca-1 (줄기 세포 항원 1분화)와섬유질1의 자궁근증 세포 마커Sca-1을 표현했습니다. 다른 연구는 대체 줄기 세포 마커의 발현에 기초하여 근육에서 중간엽 전두체의 성공적인 절연을 입증, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 (PDGFRα)2,7,8 및 추가 분석은 FAPs와 동일한 세포 집단이 될 가능성이 있음을 밝혀3. FAP는 이제 일반적으로 양성 선택 마커1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31로 Sca-1 또는 PDGFRα를 사용하여 유량 세포측정에서확인된다. . PDGFRα의 사용은 인간 조직에 우선적이지만, 뮤린 스카-1의 직접적인 인간 호모로그로 아직 확인되지 않은32. 또한, 다른 세포 표면 단백질은 FAP격리(33)에서근생 계보의 세포 지표로서 ITGA7에 대한 잠재적 대안을 제공하는 MP(예를 들어, VCAM-1)의 마커로서 보고되었다.
유동 세포측정법/FACS는 골격 근육1,9,10,11,13,29에서FAP의 역할 및 병원성 잠재력을 연구하기 위한 강력한 방법론이지만, 필요한 시약의 특이성 및 최적화에 의해 기술적으로 제한됩니다. FAP의 흐름 세포 식별 및 격리가 마우스 동물 모델1, 9,10,11,29에서개발 및 수행되었기 때문에 다른 모델 유기체에서 FAP를 연구하고자하는 연구자에게 도전이 제기됩니다. 처리될 최적의 조직 크기, 시약 및/또는 항체 특이성 및 가용성과 같은 많은 요인은 사용되는 종에 따라 다릅니다.
새로운 동물 모델에서 FAP를 연구하는 기술적 장벽 외에도, 그들은 주로 급성에서 연구되었습니다, 독성 설정 – 일반적으로 근육 화학 주입 또는 심장 독소를 통해. FAP의 장기 역학평가는 주로 듀첸의 근이영양증 에 대한 평가에 국한되어 있으며, mdx 마우스 모델9,10,11,및 동시 힘줄 트란과 기질이 어깨 근육26,27, 28, 28에서 동시 힘줄 과 기립이 수행되는 대규모 회전근 파열과 같은 조합 근육 부상의 모델 . 만성 외상성 기형의 단독 모욕에 대한 FAP의 반응, 중공업, 농업 및 출생 외상 (brachial 신경총 상해)에서 발생하는 일반적인 발생 (brachial 신경총 상해)34,35,36,37이 중요한 이환율을 가진, 종종 단기 시간 프레임11,38로제한되는 특성화되지 않았습니다.
우리는 쥐에 있는 가혹한 위축및 섬유성 골격 근뿐만 아니라 건강에서 FAP와 의원을 확인하고 격리하는 방법을 기술합니다. 첫째, 조직 소화 및 유동 세포체 염색 프로토콜을 사용하여 CD31/CD45-1+/VCAM-1-FAP 및 CD31/CD45-1-/VCAM-1+ MP의 식별이 입증되고, 분리된 세포의 배양 및 면역세포 화학적 얼룩을 통해 당사의 연구 결과의 후속 검증이 수행된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 또한 쥐에 있는 장기 고립된 기질 상해 모형에 있는 새로운 FAP 시간 과정을 보고합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
쥐 근육에 대 한 최적화 된, 검증 된 FAP 격리 프로토콜은 생물학적 또는 기술적 인 이유로 마우스에서 가능 하지 않는 부상 모델을 공부 하고자 하는 연구자에 대 한 필수적이다. 예를 들어, 마우스는 만성 국소, 또는 장기 기형 과 같은 신경 퇴행성 상해를 연구하는 최적 동물 모델이 아닙니다. 생물학적으로, 마우스의 짧은 수명과 급속한 노화는 노화의 혼란스러운 요인으로부터 의결로 인한 근육…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 오타와 대학과 생물 의학 에 대한 키난 연구 센터 (KRC), 세인트 마이클스 병원 유니티 건강 토론토의 전문 지식과 이 원고에 제시 된 흐름 세포측정 / FACS 프로토콜의 최적화에 대한 지도에 감사드립니다 흐름 세포 측정 핵심 시설에 감사드립니다. 이 작품은 JB에 디자인 새로운 아이디어 2018 기금 (MbDNI-2018-01)에 의해 의학에 의해 투자되었다.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 10 cm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3902 | |
| 12-well cell culture plate | ThermoFisher | 130185 | |
| 12 mm glass coverslips, No.2 | VWR | 89015-724 | |
| 10 mL Syringe | Beckton Dickenson | 302995 | |
| 15 mL centrifuge tubes | FroggaBio | 91014 | |
| 20 gauge needle | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25mL Serological pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50mL centrifuge tubes | FroggaBio | TB50 | |
| AbC Total Antibody Compensation Beads | ThermoFisher | A10497 | |
| Ammonium Chloride, Reagent Grade | Bioshop | AMC303.500 | |
| APC Conjugation Kit, 50-100µg | Biotium | 92307 | |
| Aquatex Aqueous Mounting Medium | Merck | 108562 | |
| Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop | CCL444.500 | |
| Collagenase Type II | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus Absolute Counting Beads | ThermoFisher | C36995 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva Software | Beckton Dickenson | — | |
| FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | 340346 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | |
| Flow Cytometry Sheath Fluid | Beckton Dickenson | 342003 | |
| FlowJo Software | Beckton Dickenson | — | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S302380-2 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21424 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | |
| Ham's F10 Media | ThermoFisher | 11550043 | (+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050-088 | |
| Hemocytometer | Reichert | N/A | |
| HEPES, minimum 99.5% titration | Sigma | H3375 | |
| Horse Serum | ThermoFisher | 16050130 | |
| Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | Also known as 2-propanol |
| Lewis Rat, Female | Charles River Kingston | 004 (Strain Code) | 200-250 grams used |
| LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer | Beckton Dickenson | — | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP Cell Sorter | Beckman Coulter | — | |
| Mouse Anti-CD31::FITC Antibody | Abcam | ab33858 | Clone TLD-3A12 |
| Mouse Anti-CD45::FITC Antibody | Biolegend | 202205 | Clone OX-1 |
| Mouse Anti-CD106::PE Antibody | Biolegend | 200403 | Also known as VCAM-1 |
| Mouse Anti-MHC Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | Also known as MF20 |
| Mouse Anti-Pax7 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | |
| Neutral Buffered Formalin, 10 % | Sigma | HT501128 | |
| Oil Red O | Millipore Sigma | O0625 | |
| PE-Cy7 Conjugation Kit | Abcam | ab102903 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride |
| Potassium Bicarbonate, Reagent Grade | Bioshop | PBC401.250 | |
| Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 also known as S100A4 |
| Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody | Abcam | ab203254 | |
| Rabbit Anti-Laminin Antibody | Sigma | L9393 | |
| Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody | Abcam | ab3526 | |
| Rabbit Anti-Sca-1 Antibody | Millipore Sigma | AB4336 | |
| Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody | Abcam | ab260043 | Also known as Col1a1 |
| Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody | Abcam | ab203491 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Gibco | PHG0266 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Troglitazone | Millipore Sigma | T2573 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510 |
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