Summary

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

Published: August 18, 2020
doi:

Summary

A integração de diversas entradas sinápticas aos neurônios é melhor medida em uma preparação que preserva todos os núcleos pré-sinápticos para o tempo natural e a plasticidade do circuito, mas as fatias cerebrais normalmente cortam muitas conexões. Desenvolvemos uma fatia cerebral modificada para imitar a atividade do circuito in vivo, mantendo a capacidade de experimentação in vitro.

Abstract

Técnicas de eletrofisiologia de fatias in vitro medem a atividade unicelular com resolução elétrica e temporal precisa. As fatias cerebrais devem ser relativamente finas para visualizar adequadamente e acessar neurônios para fixação de patches ou imagens, e o exame in vitro dos circuitos cerebrais é limitado apenas ao que está fisicamente presente na fatia aguda. Para manter os benefícios da experimentação de fatias in vitro, preservando uma porção maior de núcleos pré-sinápticos, desenvolvemos uma nova preparação de fatias. Esta “fatia de cunha” foi projetada para gravações de eletrofisiologia de grampos para caracterizar as diversas entradas monaurais, orientadas ao som para neurônios olivococlear medial (MOC) no tronco cerebral. Esses neurônios recebem suas entradas excitatórias e inibitórias primárias de neurônios ativados por estímulos no ouvido contralateral e núcleo coclear correspondente (CN). Uma fatia cerebral assimétrica foi projetada que é mais espessa no domínio rostro-caudal na borda lateral de um hemisfério e, em seguida, se inclina em direção à borda lateral do hemisfério oposto. Esta fatia contém, no lado grosso, a raiz nervosa auditiva transmitindo informações sobre estímulos auditivos para o cérebro, os circuitos intrínsecos de CN, e tanto o inibidor excitatório e trissináptico aferentes caminhos que convergem em neurônios MOC contralaterais. A gravação é realizada a partir de neurônios MOC no lado fino da fatia, onde são visualizados usando óptica DIC para experimentos típicos de grampo de remendo. A estimulação direta do nervo auditivo é realizada à medida que entra no tronco cerebral auditivo, permitindo que a atividade intrínseca do circuito CN e a plasticidade sináptica ocorram em sinapses a montante dos neurônios MOC. Com essa técnica, pode-se imitar a ativação do circuito in vivo o mais próximo possível dentro da fatia. Esta preparação de fatia de cunha é aplicável a outros circuitos cerebrais onde as análises de circuitos se beneficiariam da preservação da conectividade upstream e de entradas de longo alcance, em combinação com as vantagens técnicas da fisiologia de fatias in vitro.

Introduction

A observação da atividade dos circuitos neurais é idealmente realizada com entradas sensoriais nativas e feedback, e conectividade intacta entre regiões cerebrais, in vivo. No entanto, a realização de experimentos que dão resolução unicelular da função do circuito neural ainda é limitada por desafios técnicos no cérebro intacto. Enquanto métodos de eletrofisiologia extracelular in vivo ou imagens multifotográficas podem ser usados para investigar a atividade em sistemas nervosos intactos, interpretar como diferentes insumos se integram ou medem entradas sinápticas subestresis permanecem difíceis. Gravações in vivo de células inteiras superam essas limitações, mas são desafiadoras de realizar, mesmo em regiões cerebrais que são facilmente acessadas. Os desafios técnicos dos experimentos de resolução unicelular são ainda mais amplificados em certas populações de neurônios que estão localizadas nas profundezas do cérebro, ou em populações espacialmente difusas que requerem ferramentas genéticas para localizar células in vivo (por exemplo, expressão genética de channelrhodopsin emparelhada com gravação optrode) ou identificação histoquímica pós-hoc após a gravação do local (por exemplo, com marcadores específicos de neurotransmissão). Estando localizados difusamente perto da superfície ventral do tronco cerebral, os neurônios olivococleares medial (MOC) sofrem das limitações acima1, tornando-os extremamente difíceis de acessar para experimentação in vivo.

As fatias cerebrais (~100-500 μm de espessura) têm sido usadas há muito tempo para estudar circuitos cerebrais, incluindo circuitos de tronco cerebral auditivo, devido à segregação física de neurônios conectados que estão contidos dentro da mesma fatia2,3,4,5,6,7,8,9. Experimentos com fatias muito mais grossas (>1 mm) têm sido empregados em outros laboratórios para entender como os insumos bilaterais se integram em áreas do complexo olivary superior (SOC), incluindo a azeitona superior medial10,11. Estas fatias foram preparadas de tal forma que os axônios do nervo auditivo (AN) permaneceram intactos dentro da fatia e foram eletricamente estimulados a iniciar a liberação de neurotransmissores sinápticos no CN, imitando a atividade dos neurônios auditivos de primeira ordem como eles responderiam ao som. Uma grande desvantagem dessas fatias grossas é a visibilidade dos neurônios para gravações eletrofisiológicas de grampo de remendo (“patching”). A remenda torna-se cada vez mais difícil à medida que os numerosos axônios nesta área tornam-se mieliados com12,13,14,15anos, tornando o tecido opticamente denso e obscurecendo neurônios mesmo em uma típica fatia cerebral fina. Nosso objetivo é criar preparações in vitro que se assemelham mais à conectividade do circuito de gravações in vivo, mas com as habilidades de gravação de alta produtividade e alta resolução da eletrofisiologia de grampos visualmente guiados em fatias cerebrais.

Nosso laboratório investiga a fisiologia dos neurônios do sistema auditivo e diferente, incluindo neurônios MOC. Estes neurônios colinérgicos fornecem feedback eferente à cóclea, modulando a atividade das células ciliares externas (OHCs)16,17,18,19,20. Estudos anteriores mostraram que essa modulação desempenha um papel no controle de ganhos na cóclea21,22,23,24,25,26 e proteção contra trauma acústico27,28,29,30,31,32,33. Em camundongos, os neurônios MOC estão divididos no núcleo ventral do corpo trapezoide (VNTB) no tronco cerebral auditivo1. Nosso grupo utilizou a linha de mouse ChAT-IRES-Cre cruzada com a linha de rato repórter tdTomato para atingir neurônios MOC em fatias de tronco cerebral sob iluminação epifluorescente. Mostramos que os neurônios MOC recebem uma entrada inibitória diferente do núcleo medial ipsilateral do corpo trapezoide (MNTB), que é animado, por sua vez, por axônios de células espessas globulares (GBC) no núcleo coclear contralateral (CN)34,35,36,37,38. Além disso, os neurônios MOC provavelmente recebem sua entrada excitatória de células T-estelares no CN39,40,41. Juntos, esses estudos mostram que os neurônios MOC recebem insumos excitatórios e inibitórios derivados do mesmo ouvido (contralateral). No entanto, os neurônios pré-sinápticos, e seus axônios convergindo em neurônios MOC, não são suficientemente próximos um do outro para estarem totalmente intactos em uma típica preparação de fatias coronais. Para investigar como a integração de entradas sinápticas aos neurônios MOC afeta seus padrões potenciais de ação, com foco na inibição recém-descrita, desenvolvemos uma preparação na qual poderíamos estimular os diversos afferents aos neurônios MOC de um ouvido da maneira mais fisiologicamente realista possível, mas com os benefícios técnicos de experimentos in vitro de fatias cerebrais.

A fatia de cunha é uma preparação de fatia grossa modificada projetada para a investigação da integração do circuito em neurônios MOC (esquematizado na Figura 1A). No lado grosso da fatia, a cunha contém os axônios decepados do nervo auditivo (denominado “raiz nervosa auditiva” daqui em diante) à medida que entram no tronco cerebral da periferia e da sinapse no CN. A raiz nervosa auditiva pode ser estimulada eletricamente para evocar a liberação de neurotransmissores e a ativação sináptica das células do CN42,43,44,45,46. Este formato de estimulação tem vários benefícios para a análise do circuito. Primeiro, em vez de estimular diretamente os axônios T-stellate e GBC que fornecem uma entrada diferente aos neurônios MOC, estimulamos o AN para permitir a ativação de circuitos intrínsecos abundantes no CN. Esses circuitos modulam a saída de neurônios CN para seus alvos em todo o cérebro, incluindo neurônios MOC46,47,48,49,50,51. Em segundo lugar, a ativação polissináptica de circuitos diferentes do AN através do a montante CN dos neurônios MOC permite que um tempo de ativação mais natural e para a plasticidade ocorra nessas sinapses como ocorreriam in vivo durante a estimulação auditiva. Terceiro, podemos variar nossos padrões de estimulação para imitar uma atividade. Finalmente, tanto as projeções monaural excitatórias quanto inibitórias para os neurônios MOC estão intactas na fatia da cunha, e sua integração pode ser medida em um neurônio MOC com a precisão da eletrofisiologia de grampo de remendo. Como um todo, este esquema de ativação fornece um circuito mais intacto para os neurônios MOC em comparação com uma preparação típica de fatia cerebral. Esta fatia de cunha do tronco cerebral também pode ser usada para investigar outras áreas auditivas que recebem insumos inibitórios do MNTB ipsilateral, incluindo a azeitona superior lateral, o núcleo olivary superior e a azeitona superior medial10,11,52,53,54,55,56. Além de nossa preparação específica, este método de corte pode ser usado ou modificado para avaliar outros sistemas com os benefícios de manter a conectividade de entradas de longo alcance e melhorar a visualização de neurônios para uma variedade de técnicas de eletrofisiologia de resolução unicelular ou de imagem.

Este protocolo requer o uso de um estágio ou plataforma vibratome que pode ser inclinado aproximadamente 15°. Aqui usamos um estágio magnético de 2 peças comercialmente disponível onde o “palco” é um disco de metal com um fundo curvo colocado em uma “base de estágio” magnética côncava. O estágio pode então ser deslocado para ajustar o ângulo da fatia. Círculos concêntricos na base do palco são usados para estimar o ângulo de forma reprodutível. O estágio e a base do palco são colocados na câmara de corte, onde a base do estágio magnético também pode ser girada.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC/Instituto Nacional de Surdez e Outros Transtornos de Comunicação Do Comitê de Cuidado e Uso de Animais. 1. Preparações experimentais NOTA: Detalhes sobre a preparação de fatias, incluindo solução de corte, temperatura de corte, temperatura de incubação de fatias e aparelhos (etc.) são específicos para a preparação do tronco cerebral realizada …

Representative Results

Exame histológico da fatia de cunhaPara nossa investigação da função auditiva do neurônio brainstem, a preparação da fatia de cunha foi projetada para conter a raiz nervosa auditiva e o contralateral CN aos neurônios MOC destinados às gravações (exemplo de fatia mostrada na Figura 1B). O exame histológico inicial da preparação é importante para confirmar que a fatia contém os núcleos necessários para a ativação do circuito e que as projeções axonai…

Discussion

O procedimento de corte descrito aqui chamado de fatia de cunha é poderoso para manter circuitos neuronais pré-sinápticos intactos, mas com a acessibilidade da experimentação de fatias cerebrais para análise da função neuronal. Deve-se tomar muito cuidado em várias etapas iniciais, a fim de maximizar a utilidade da preparação para a análise do circuito. As dimensões da cunha devem ser confirmadas por meio do exame histológico, que é essencial para a confirmação de que tanto os núcleos pré-sinápticos q…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do NIH, NIDCD, Z01 DC0000091 (CJCW).

Materials

Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

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Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

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