Aquí presentamos un método que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección para generar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sin necesidad de transfección génica o vectores retrovirales. Esta estrategia es, por lo tanto, prometedora para la medicina traslacional y representa un avance notable en la tecnología de organoides de células madre.
El fenotipo celular puede ser revertido o modificado con diferentes métodos, con ventajas y limitaciones que son específicas para cada técnica. Aquí describimos una nueva estrategia que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección, para generar células pluripotentes de mamíferos. Se requieren dos pasos principales. En el primer paso, las células adultas maduras (diferenciadas terminalmente) se exponen al borrador epigenético 5-aza-citidina para llevarlas a un estado pluripotente. Esta parte del protocolo se desarrolló, basada en la creciente comprensión de los mecanismos epigenéticos que controlan el destino y la diferenciación celular, e implica el uso del modificador epigenético para borrar el estado diferenciado celular y luego conducir a una ventana transitoria de alta plasticidad.
En el segundo paso, las células borradas se encapsulan en microbiorreactores de politetrafluoroetileno (PTFE), también conocidos como mármoles líquidos, para promover el reordenamiento celular 3D para extender y mantener de manera estable la alta plasticidad adquirida. El PTFE es un compuesto sintético hidrófobo no reactivo y su uso permite la creación de un microambiente celular, lo que no se puede lograr en los sistemas tradicionales de cultivo 2D. Este sistema fomenta e impulsa el mantenimiento de la pluripotencia a través de señales relacionadas con la biomenosensing.
Los procedimientos técnicos descritos aquí son estrategias simples para permitir la inducción y el mantenimiento de un estado de alta plasticidad en células somáticas adultas. El protocolo permitió la derivación de células de alta plasticidad en todas las especies de mamíferos probadas. Dado que no implica el uso de la transfección génica y está libre de vectores virales, puede representar un avance tecnológico notable para las aplicaciones de la medicina traslacional. Además, el sistema de microbiorreactor proporciona un avance notable en la tecnología de organoides de células madre mediante la recreación in vitro de un microambiente específico que permite el cultivo a largo plazo de células de alta plasticidad, es decir, como ESC, iPSC, células borradas epigenéticamente y MSC.
Durante las últimas décadas, se revisó por completo el concepto ampliamente aceptado de progresión unidireccional hacia el compromiso y la diferenciación celular. Se ha demostrado que la especificación celular puede ser revertida, y una célula diferenciada terminalmente puede ser empujada hacia un estado menos comprometido y más permisivo, utilizando diferentes métodos.
Entre los varios métodos propuestos, uno de los métodos más prometedores implica el uso de compuestos químicos para inducir a las células a una llamada pluripotencia inducida químicamente. Las pequeñas moléculas utilizadas en este abordaje son capaces de interactuar y modificar la firma epigenética de una célula adulta madura, evitando la necesidad de cualquier vector transgénico y/o viral 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Numerosos estudios han demostrado recientemente que es posible cambiar las células de un fenotipo a otro proporcionando estímulos bioquímicos y biológicos específicos que inducen la reactivación de genes hipermetilados 11,12,13,14,15. Estos eventos desmetilantes permiten la conversión de células diferenciadas terminalmente en un progenitor primitivo, una célula multipotente o de alta plasticidad/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Paralelamente, muchos estudios se han centrado recientemente en la comprensión de las señales relacionadas con la mecanodetección y, más concretamente, en la posibilidad de utilizar fuerzas mecánicas para influir directamente en la plasticidad y/o diferenciación celular 16,17,18,19. De hecho, se ha demostrado claramente que la matriz extracelular (ECM) juega un papel clave en el control del destino celular. En particular, las señales biomecánicas y biofísicas producidas por la ECM regulan directamente los mecanismos moleculares y las vías de señalización, influyendo en el comportamiento y las funciones celulares20,21. Estos datos recientes han allanado el camino para el desarrollo de nuevos sistemas de cultivo 3D que imitan más de cerca el microambiente celular in vivo, replicando estímulos mecánicos y físicos que impulsan el comportamiento celular.
Aquí describimos un protocolo de dos pasos que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección, para generar células pluripotentes de mamíferos. En el primer paso, las células se incuban con la molécula desmetilante 5-aza-citidina (5-aza-CR). Este agente es capaz de inducir una significativa desmetilación global del ADN a través de un efecto combinado de la acción directa mediada por la translocación 2 (TET2) 8,10 y la inhibición indirecta de las ADN metiltransferasas (DNMT)22,23. Este paso induce la eliminación de los bloqueos epigenéticos con una posterior reactivación de la expresión génica relacionada con la pluripotencia y, por tanto, la generación de células de alta plasticidad 1,2,3,8,10, en adelante denominadas “células borradas epigenéticamente”. En el segundo paso, las células se encapsulan en un sistema de cultivo 3D. Para ello, se utiliza como microbiorreactor el compuesto sintético hidrofóbico no reactivo politetrafluoroetileno (PTFE; con un tamaño de partícula de 1 μm), que permite la creación de un microambiente celular inalcanzable mediante el uso de sistemas tradicionales de cultivo 2D10. Las partículas de polvo de PTFE se adhieren a la superficie de la gota líquida en la que las células se vuelven a suspender y aíslan el núcleo líquido de la superficie de soporte, al tiempo que permiten el intercambio de gases entre el líquido interior y el entorno circundante24. El “microbiorreactor de PTFE” así obtenido, también conocido como “Mármol Líquido”, anima a las células a interactuar libremente entre sí, promoviendo el reordenamiento celular 3D 25,26,27, y extiende y mantiene de forma estable el estado de alta plasticidad adquirido a través de señales relacionadas con la biomenosensibilidad 10.
Durante las últimas décadas, varios estudios se centraron en el desarrollo de estrategias para revertir una célula diferenciada terminalmente hacia un estado menos comprometido y más permisivo. El protocolo aquí descrito permite la generación y el mantenimiento a largo plazo de células pluripotentes a partir de células adultas maduras diferenciadas terminalmente. El método combina dos pasos independientes que implican la inducción de un alto estado permisivo que se logra a través del borrado epigenético quím…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por la Fundación Carraresi y MiND FoodS Hub ID: 1176436. Todos los autores son miembros de la Acción COST CA16119 Guía y aptitud celular total 3-D in vitro (CellFit).
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |