有害刺激センシングのための定量的行動読み出しとしてのプラナリアンスクランチング
Summary
淡水プラナリアンは、定量的行動分析によって区別できる3つの歩行(滑空、蠕動、およびスクランチ)を示す。我々は、様々な有害刺激、その定量、および蠕動および滑空との区別を用いてスクランチを誘導する方法を記述する。遺伝子ノックダウンを用いて、定量的表現読み出しとしてスクランチングの特異性を実証する。
Abstract
淡水のプラナリアンは、通常、腹側の毛様体の推進力を通って滑らかに滑空します。しかし、特定の環境条件は、運動性主導の移動形態である蠕動またはスクランチを誘発する可能性がある。蠕動は毛様体欠損から生じるが、スクランチは繊毛機能から独立しており、切断、有害温度、極端なpH、エタノールを含む特定の刺激に対する特異的な反応である。したがって、これら2つの筋肉駆動の足取りは、機械学的に異なっている。しかし、質的に区別することは困難です。ここでは、様々な物理的および化学的刺激を用いてスクランチを誘導するためのプロトコルを提供します。自由に利用できるソフトウェアを用いて、蠕動や滑空と区別するために使用できるスクランチングの定量的特徴について詳しく説明します。スクランチは、特徴的な種固有の違いはあるものの普遍的なプラナリアン歩行であるため、このプロトコルは、適切な考慮事項を使用する場合、すべての種のプラナリアンに広く適用することができます。これを実証するために、行動研究で使用される2つの最も人気のあるプラナリアン種、 ドゥゲシア・ジャポニカ と シュミテア・メディテラニアの反応を、物理的および化学的刺激の同じセットと比較する。さらに、スクランチングの特異性により、このプロトコルをRNA干渉および/または薬理学的暴露と組み合わせて使用して、関係する分子標的および神経回路を解剖し、ノシセプションおよび神経筋コミュニケーションの重要な側面に対する機械的な洞察を提供する可能性がある。
Introduction
,幹細胞や再生,研究1、2、32に人気の他1に、淡水プラナリアンは、比較的大きなサイズ(長さが数ミリメートル)、簡単で低コストの実験室のメンテナンス、および観察可能な行動の広いスペクトルを利用して、行動研究34、5で長い間使用されてきました。5コンピュータビジョンと自動追跡をプラナリアン行動研究676、7、8、9、10、11に導入すると、行動型の定量的分化が8,9,10,11可能になりました。,,動物の行動は、神経機能の直接の読み出しです。プラナリアン神経系は中規模で複雑であるが、脊椎動物の脳12、13、1413,14と共に保存された重要な要素を共有するため、プラナリアンの行動を研究することは、より複雑な生物で直接探査するのが難しいニューロン作用の保存されたメカニズムに関する洞察を提供することができる。12したがって、プラナリアンは、比較神経生物学研究,,,88、12、15、16、17、18、19、20、21,12,15,16の貴重なモデルです。,2119,201718さらに、水生環境は、再生および成人プラナリアンにおける脳機能への影響を研究するために化学物質への迅速かつ容易な暴露を可能にし、神経毒性学22、23、24、25、26のための人気のシステムにする。,23,24,25,26
プラナリアンは、滑空、蠕動、スクランチと呼ばれる3つの異なる足取りを持っています。各歩行は、特定の状況下で展示されています:滑空はデフォルトの歩行であり、毛様体機能が損なわれると蠕動が起こり、27シリア機能から独立したエスケープ歩行である – 特定の有害な刺激に応答して7。我々は、スクランチングは、極端な温度またはpH、機械的損傷、または特定の化学的誘導物質を含む特定の化学的または物理的手がかりの感覚によって引き起こされ、したがって一般的なストレス応答77、28、2928,29ではないことを示している。
このプロトコルを使用して容易に定量化することができるその特異性およびステレオタイプのパラメータのために、スクランチングは、研究者が行動25、28,28の感覚経路および神経制御を解剖する機械学的研究を行うことを可能にする強力な行動表現型である。さらに、スクランチングは,、神経毒性学研究22、24、25、30における神経系の発達および機能に対する22,24,有害な化学的影響をアッセイする敏感なエンドポイントであることが示されている。2530いくつかの異なる感覚経路が様々なメカニズム28を通してしゃがみを誘発するために収束するように見えるので、様々だが特定の刺激を使用して異なる神経回路を解剖し、異なる信号がどのように統合され、異なるシグナルタイプを産生するかを研究することができるので、スクランチは他のプラナリアン行動とは異なる。
重要なことに、種の違いは存在し、ある化学物質はあるプラナリアン種でスクランチを引き起こすかもしれないが、別のプラナリアン種では異なる行動反応を引き起こす可能性がある。例えば、アナンダミドは、平面種ドゥゲシア・ジャポニカでスクランチを誘発するが、シュミネア地中海28で蠕動を誘発することを発見した。この例では、異なる分子機構の明白な現れであるため、異なる歩行を確実に区別できることの重要性を強調しています。しかし、両足歩行は筋力主導であり、質的類似性,を共有するため、蠕動性と蠕動の区別は、質的観察データを使用して困難である。したがって、歩行を区別するには、繊毛イメージングまたは定量的行動研究を行う必要があり、これは特性パラメータ77,2828に基づく区別を可能にする。繊毛イメージングは実験的に困難であり、高倍率の化合物顕微鏡や高速カメラ77、2828などの特殊な装置を必要とするため、定量的行動分析ほど研究者が普及することは不可能です。
ここでは、(1)様々な物理的(有害温度、切断、近紫外線)および化学(アリルイソチオシアネート(AITC)、シナアルデヒド)刺激を用いたスクランチの誘導と(2)自由に入手可能なソフトウェアを用いたプラナリアン行動の定量分析のためのプロトコルを提示する。4つのパラメータ(身体長振動の周波数、相対速度、最大振幅、および体伸びと収縮の非対称性)を定量化することにより、スクランチングは、ヘビ様移動運動15やてんかん15などの文献で報告される滑空、蠕動、その他の行動状態と区別することができる。15さらに、スクランチングは、異なるプラナリアン種7の間で保存されているが、各種は、独自の特徴的な周波数と速度を有する。したがって、種の滑空速度とスクランチ速度が決定されると、速度だけでは滑空および蠕動29とスクランチを区別する手段として使用することができる。このプロトコルは、計算画像解析や行動研究における事前の訓練を前提としないため、学部レベルの教育研究室の文脈におけるプラナリアン行動実験にも適用することができます。プロトコルの適合を容易にするデータの例は補足資料に記載されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルを使用すると、物理および化学的刺激,7、28、29または遺伝子操作(RNAi)28、29のプラ28,29ナリアン移動の影響を定量的に研究することができます。72829空間解像度を最大限に高めるには、アリーナ全体が視野に入っていることを確認しながら、カメラをできるだけア?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、原稿に関するコメントに対するタタン・ゴエル氏に感謝する。この作品は、NSFキャリアグラント1555109によって資金提供されました。
Materials
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
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