Microdissection laser RNA-Sequenciamento para Análise de Expressão Genética Espacial e Temporal-Específica do Tecido em Plantas
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para microdisseção de captura a laser (LCM) de tecidos vegetais. LCM é uma técnica microscópica para isolar áreas de tecido de forma livre de contaminação. O procedimento inclui fixação tecidual, incorporação de parafina, secção, LCM e extração de RNA. O RNA é usado na análise temporalmente resolvida do tecido a jusante dos transcriptomes.
Abstract
O desenvolvimento de um complexo organismo multicelular é regido por tipos de células distintas que têm diferentes perfis transcricionais. Para identificar redes regulatórias transcricionais que regem os processos de desenvolvimento é necessário medir os perfis de expressão genética espacial e temporal desses tipos de células individuais. Portanto, a visão sobre o controle espóvio-temporal da expressão genética é essencial para obter a compreensão de como os processos biológicos e de desenvolvimento são regulados. Aqui, descrevemos um método de microdissecção de captura a laser (LCM) para isolar um pequeno número de células de três órgãos de embrião de cevada durante um curso de tempo durante a germinação seguido de perfil de transcrição. O método consiste em fixação tecidual, processamento de tecidos, incorporação de parafina, secção, LCM e extração de RNA seguido de PCR em tempo real ou RNA-seq. Este método nos permitiu obter perfis espaciais e temporais de transcritos de órgãos de sementes de diferentes números de células (dezenas a centenas), fornecendo uma especificidade tecidual muito maior do que as análises típicas de tecido a granel. A partir desses dados, conseguimos definir e comparar redes regulatórias transcricionais, bem como prever fatores de transcrição regulatória de candidatos para tecidos individuais. O método deve ser aplicável a outros tecidos vegetais com otimização mínima.
Introduction
O desenvolvimento e o crescimento das plantas envolvem a ação coordenada de redes reguladoras transcricionais dentro de diferentes células que existem em um ambiente celular complexo. Para entender a atividade dessas redes regulatórias, exigimos o conhecimento da expressão genética espacial e temporal dentro de diferentes tipos de células em estágios de desenvolvimento. No entanto, as análises da expressão genética são mais comumente conduzidas em órgãos inteiros ou amostras de tecido a granel devido ao desafio técnico de isolar e analisar um pequeno número de células. O método que descrevemos aqui permitiu a obtenção de análises de transcriptome espacial e temporal específicas do tecido, acoplando LCM com RNA-seq.
O LCM foi desenvolvido há duas décadas pela Emmert-Buck e pelos colegas1. A técnica permitiu aos pesquisadores isolar precisamente células únicas ou aglomerados de células de seu ambiente usando visualização e manipulação microscópica direta com um laser de feixe estreito1. Desde então, o método tem sido amplamente utilizado em biologia do câncer e patologia2,3. Muitos grupos de pesquisa vegetal também adaptaram LCM para uso com diferentes espécies de plantas e diferentes tipos de tecidos4,,5,,6,,7,8,,9,,10,,11. Recentemente, vários artigos também utilizaram LCM em sementes de eudicot e monocot para estudar embriões, endospermos e outras estruturas de sementes durante o desenvolvimento de sementes e germinação10,,12,,13. A maioria dos outros métodos de isolamento unicelular comumente usados, como micro-pipetação, classificação celular, separação magnética e plataformas microfluidas dependem da digestão enzimática ou homogeneização mecânica para dissociar células. Isso pode perturbar a expressão genética, introduzindo artefatos técnicos que confundem a interpretação dos dados14,15. Esses métodos também requerem conhecimento prévio de genes marcadores para cada tipo de célula para relacionar as células dissociadas à sua localização espacial e ao verdadeiro tipo celular. Um outro grupo de técnicas depende do isolamento baseado em afinidade de estruturas subcelulares em vez de células inteiras, como INTACT (Isolamento de Núcleos Marcados em Tipos de Células) e TRAP (Traduzindo Purificação de Afinidade Ribossome)16,17. No entanto, a rotulagem e purificação de núcleos ou ribossomos são tecnicamente desafiadoras em espécies vegetais que não possuem protocolos de transformação bem estabelecidos. O LCM aproveita a fixação rápida do tecido para preservar os níveis de transcrição e a identificação histológica convencional por visualização direta das células dentro de seu contexto normal de tecido/órgão, o que permite que células discretas sejam isoladas em um curto período de tempo18,19.
O protocolo aqui apresentado é um método otimizado para o isolamento de células específicas ou tipos celulares das seções teciduais das sementes de cereais, que podem ser aplicadas à maioria das células que podem ser histologicamente identificadas. O LCM fornece um método livre de contatos de isolamento celular, reduzindo consideravelmente a contaminação e aumentando a integridade do RNA recuperado. Além disso, o método ilustra o poder do LCM em estudos de grande escala de genomas, começando com pequenas quantidades de materiais biológicos. Também descrevemos a amplificação linear do RNA para gerar material de entrada suficiente para análises de transcrição/transcriptome a jusante.
Existem dez etapas principais neste protocolo LCM RNA-seq para transcriçãos espaciais e temporais específicas do tecido, incluindo fixação de amostras de tecido, desidratação, infiltração de parafina, incorporação, secção, LCM, extração de RNA, amplificação de RNA, quantificação de RNA e qRT-PCR e/ou RNA-seq(Figura 1).
Figura 1: Fluxograma de LCM seguido por RNA-seq ou qRT-PCR. LCM é uma técnica espacialmente precisa e livre de contatos para coletar células de seções de tecido fixo usando um raio laser sob visualização microscópica. O processo começa com fixação de amostras de tecido, seguido de desidratação usando uma série gradiente de etanol e xileno, e finalizado com infiltração de parafina. O processo pode ser totalmente automatizado usando um processador de tecido. Uma vez que o tecido é infiltrado com parafina, ele é incorporado em um molde com parafina derretida usando uma estação de incorporação. A secção é realizada utilizando-se microtoma definido para a espessura desejada. Slides são preparados e LCM conduzido imediatamente antes do RNA deve ser extraído das células capturadas. A extração de RNA é seguida diretamente por duas rodadas de amplificação de RNA antes do qRT-PCR e/ou RNA-seq. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muitos estudos de expressão genética específicos do tecido têm sido limitados pela dissecação manual de amostras, que é demorado, trabalhoso, tem um alto risco de contaminação e só pode utilizar amostras que um agente humano é suficientemente hábil para colher. LCM é uma técnica precisa e livre de contatos para coletar células de seções de tecido fixo usando um raio laser operado mecanicamente sob visualização microscópica.
Uma boa preparação amostral é fundamental para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) para jw. M.G.L foi apoiado por uma bolsa inicial da Universidade La Trobe. Agradecemos à Plataforma de Genômica La Trobe por seu apoio em sequenciamento de alta produtividade e análise de dados. Agradecemos ao Professor Associado Matthew Tucker por conselhos especializados sobre a criação de LCM em nosso laboratório.
Materials
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).
- Cong, P., et al. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).
- Blokhina, O., et al. Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants. Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).
- Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).
- Chen, Z., et al. LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.). The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).
- Jiao, Y., et al. A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies. Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).
- Kivivirta, K., et al. A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms. Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
- Matas, A. J., et al. Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation. The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).
- Sakai, K., et al. Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo. Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).
- Zhan, J., et al. RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. . Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get. Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).
- Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells. Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
- Takahashi, H., et al. A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).
- Ferreira, E. N., et al. Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA. Gene. 564 (2), 220-227 (2015).
- Schneider, J., et al. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).
- Shanker, S., et al. Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).
- Bhattacherjee, V., et al. Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells. Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Blokhina, O., et al. Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce. Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).
- Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples. Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).
- Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).
- Latrasse, D., et al. The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 22 (2017).
- Turco, G. M., et al. DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor. The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).
- Gomez, S. K., Harrison, M. J. Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).
- Roux, B., et al. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing. The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).
- Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).
