Aqui, descrevemos um método para aquecer blastocistos humanos vitrificados, culminando-os através do período de implantação in vitro, digerindo-os em células únicas e coletando células trophoblastas precoces para uma investigação mais aprofundada.
A implantação humana, a apposição e a adesão à epitélia da superfície uterina e a subsequente invasão do blastocisto na decidua materna, é um evento biológico crítico, mas enigmático, historicamente difícil de estudar devido a limitações técnicas e éticas. A implantação é iniciada pelo desenvolvimento do trophectoderm ao trophoblasto e posterior diferenciação em sublineagens trophoblastos distintas. A diferenciação do trophoblasto precoce aberrante pode levar à falha de implantação, patologias placentárias, anormalidades fetais e aborto. Recentemente, foram desenvolvidos métodos para permitir que embriões humanos cresçam até o dia 13 pós-fertilização in vitro na ausência de tecidos maternos, período de tempo que abrange o período de implantação em humanos. Isso deu aos pesquisadores a oportunidade de investigar a implantação humana e recapitular a dinâmica da diferenciação do trophoblasto durante esse período crítico sem confundir influências maternas e evitar obstáculos inerentes ao estudo de eventos de diferenciação de embriões precoces in vivo. Para caracterizar diferentes sublinemas trophoblastos durante a implantação, adotamos métodos de cultura estendidos bidimensionais (2D) existentes e desenvolvemos um procedimento para digerir esnzimaticamente e isolar diferentes tipos de células trophoblastos para ensaios a jusante. Embriões cultivados em condições 2D têm uma morfologia relativamente achatada e podem ser subótimos na modelagem in vivo tridimensionais (3D) arquiteturas embrionárias. No entanto, a diferenciação do trophoblasto parece ser menos afetada, como demonstrado pela morfologia antecipada e mudanças na expressão genética ao longo da cultura estendida. Diferentes sublineagens trophoblastos, incluindo citotrofoblasto, sinintólogo e trophoblasto migratório podem ser separadas por tamanho, localização e emergência temporal, e usadas para caracterização ou experimentação. A investigação dessas células trophoblastos precoces pode ser fundamental na compreensão da implantação humana, no tratamento de patologias placentárias comuns e na mitigação da incidência de perda de gravidez.
A implantação humana e o surgimento da placenta precoce são historicamente difíceis de investigar e permanecem em grande parte desconhecidos porque os tecidos humanos são inacessíveis nesta fase em que a gravidez é clinicamente indetectável. Modelos animais são inadequados, pois a placenta humana tem suas próprias características únicas em comparação com outros mamíferos euterianos. Por exemplo, a placenta humana invade profundamente a decidua com algumas células trophoblastas atingindo pelo menos o terço interno do miométrio uterino, enquanto outras células remodelam as artérias espiral uterinas. Mesmo nossos ancestrais evolutivos mais próximos, os primatas não humanos, mostram diferenças na morfologia placentária e interações trophoblastos com os tecidos deciduais maternos1,,2,3. A obtenção de embriões humanos pré-implantação in vitro não era possível até a década de 1980, quando a fertilização in vitro humana clínica (FIV) começou como uma prática de rotina para o tratamento da infertilidade4. Agora, blastocistos humanos podem ser cultivados in vitro para permitir a seleção de embriões mais viáveis para transferência, bem como permitir testes genéticos seguros. A melhoria das técnicas de cultura de embriões, bem como o uso crescente de FIV, produziram muitos blastocistos excedentes que permanecem após a conclusão dos ciclos de tratamento do paciente. Com o consentimento do paciente, aprovação do IRB e com certas restrições, esses blastocistos podem ser utilizados para estudos de pesquisa. Tornaram-se um recurso inestimável que foi utilizado para a derivação de células-tronco embrionárias humanas5, entendendo a transição da massa celular interna para células-tronco embrionárias6,,7e, mais recentemente, foram cultivadas com sucesso até o dia (D) 13 para remodelar a implantação humana8,,9. Ao utilizar abordagens de omics unicelulares recém-desenvolvidas, o acesso a esses tecidos embriões humanos em estágio de implantação tem oferecido oportunidades únicas para descrever os mecanismos moleculares que regulam esse processo de diferenciação celular altamente dinâmico, que antes eram impossíveis de explorar10,,11,,12,13.
Aqui, descrevemos os métodos utilizados em nossa recente publicação caracterizando a dinâmica da diferenciação do trophoblasto durante a implantação humana12. Este protocolo inclui o aquecimento de blastocistos vitrificados, cultura de embriões estendida até D12 pós FIV, digestão enzimática do embrião em células únicas e coleta de células para ensaios a jusante(Figura 1). Este sistema de cultura estendida apoia o desenvolvimento de embriões humanos em estágio de peri-implantação sem insumo materno e recapitula a diferenciação do trophoblasto que parece consistente com as observações feitas a partir de espécimes histológicos há muitos anos14,,15,,16,17. Durante a implantação, a população de trophoblasto é composta por pelo menos dois tipos de células: o citotrofoblasto progenitor mononucleado (CTB) e o sintiotrofost (STB) internucleado, diferenciado terminalmente diferenciado. Após a digestão da trippsina, o CTB são células pequenas e redondas que são morfologicamente indistinguíveis de outras linhagens celulares(Figura 2A, painel esquerdo). A separação do CTB de outras linhagens celulares, como epiblasto e endoderme primitivo, pode ser alcançada por seus distintos perfis transcriômicos revelados pelo sequenciamento de RNA de célula única. As células sincitotrofoblastos podem ser facilmente identificadas como estruturas de forma irregular que são significativamente maiores que os outros tipos de células e localizadas principalmente na periferia do embrião (Figura 2A, painel médio; Figura 2B, painel esquerdo). As células de trophoblasto migratório (MTB) são outra sublineagem trophoblasto encontrada durante a cultura estendida do embrião e podem ser reconhecidas como aparentemente se afastando do corpo principal do embrião (Figura 2A, painel direito, Figura 2B, painel direito). O trophoblasto migratório, embora expresse muitos dos mesmos marcadores do trophoblasto extra villous (EVT), não deve ser referido como EVT, uma vez que as estruturas villous na placenta não surgiram neste estágio inicial de desenvolvimento.
Experimentalmente, conseguimos coletar pequenos CTB e STB grandes que são facilmente distinguíveis depois que embriões são digeridos em células únicas em D8, D10 e D12 (Figura 2A,B). Os trophoblastos migratórios surgem nos estágios posteriores da cultura de embriões estendidos e podem ser coletados em D12 antes da digestão enzimática de todo o embrião (Figura 2A,B). Ao separar fenotipicamente essas três sublineagens trophoblastos antes da análise de células únicas, podemos identificar marcadores transcriômicos específicos e definir o papel biológico de cada tipo de célula. O citotrofoblasto é altamente proliferativo e atua como células progenitoras no fornecimento das linhagens diferenciadas STB e MTB10,,11,,12,,13. O sinintismotrofã está envolvido na produção de hormônios placentários para manter a gravidez e também pode ser responsável pelos embriões que penetram no endométrio10,,11,12,13. O trophoblasto migratório tem características ainda mais fortes de um fenótipo migratório invasivo e migratório e são provavelmente responsáveis pela colonização mais profunda e extensa do endométrio uterino10,,11,,12,13. Após a definição da assinatura transcriômica de cada tipo de célula, as análises de agrupamento também revelaram dois subconjuntos adicionais de células que eram morfologicamente indistinguíveis da CTB e tinham transcriptomes com características de STB e MTB,respectivamente 12. Essas células de estágio intermediário provavelmente estão no processo de diferenciação do CTB para as sublineagens MTB ou STB e teriam sido negligenciadas se os embriões fossem digeridos cegamente e as células fossem separadas apenas por transcriptome.
O protocolo descrito aqui utiliza um sistema de cultura bidimensional (2D) e pode não ser ideal para suportar o desenvolvimento estrutural tridimensional (3D), como sugerido por uma publicação recente descrevendo um recém-desenvolvido sistema de cultura 3D13. No entanto, neste sistema 2D a diferenciação do trophoblast precoce parece ser consistente com observações feitas a partir de espécimes in vivo14,,15,,16,17. Este protocolo também pode ser facilmente adaptado para o uso no recém-descrito sistema de cultura 3D13 com mudanças mínimas. Todas as etapas são realizadas com uma pipeta de micromanipulação portátil com pontas descartáveis comercialmente disponíveis ou uma pipeta bucal de uma pipeta de vidro finamente puxada presa a tubos de borracha, um filtro e um porta-voz.
O desenvolvimento do protocolo para cultivar embriões humanos através da implantação permitiu aos cientistas explorar um tempo anteriormente inexplorado no desenvolvimento8,,9. Aqui, usamos um sistema de cultura estendido para cultivar embriões humanos e estudar a diferenciação do trophoblasto precoce antes da formação de placenta villous. Os métodos aqui descritos permitem coletar diferentes sublineagens de TB para uso na análise de células únicas a…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de reconhecer os muitos pacientes do Centro de Medicina Reprodutiva do Colorado (CCRM) que graciosamente doaram seus embriões para pesquisa. Também gostaríamos de agradecer a Karen Maruniak e ao laboratório clínico da CCRM por sua ajuda no processamento de amostras de hCG, bem como Sue McCormick e sua equipe clínica de embriologia de FIV na CCRM por sua ajuda na coleta, armazenamento, rastreamento e doação de embriões. O financiamento foi fornecido internamente pela CCRM.
3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |