תסכולת הזנה דרך הפה חיידקית עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה של חיידקים בודדים מעיים יתוש, כולל בידוד וזיהוי של חיידקים midgut יתושים, דלדול אנטיביוטיקה של חיידקים מעיים יתוש, ולהחזן מחדש מין אחד חיידקים ספציפיים.
Abstract
היתוש midgut נמלים microbiome דינמי מאוד המשפיע על חילוף החומרים המארח, רבייה, כושר, ויכולת וקטורית. מחקרים נערכו כדי לחקור את ההשפעה של חיידקים במעיים ככלל; עם זאת, חיידקים שונים יכולים להפעיל השפעות ברורות כלפי המארח. מאמר זה מספק את המתודולוגיה כדי ללמוד את ההשפעה של כל מיקרוב ספציפי מעיים יתוש ואת המנגנון הפוטנציאלי.
פרוטוקול זה מכיל שני חלקים. החלק הראשון מציג כיצד לנתח את מידגוט היתוש, לבודד מושבות חיידקים cultivable, ולזהות מינים חיידקים. החלק השני מספק את ההליך כדי ליצור יתושים שטופלו באנטיביוטיקה ולהריח מחדש מין אחד ספציפי חיידקים.
Introduction
יתושים נחשבים וקטורים החשובים ביותר של מחלות פתוגנית אנושית, העברת מעל מאה פתוגנים כולל וירוס זיקה, וירוס דנגה, טפילי Plasmodium 1. כאשר יתושים לקחת ארוחת דם כדי לרכוש חומרים מזינים עבור oviposition, הם יכולים בטעות בלע פתוגנים ממארח נגוע דרך מערכת העיכול2. חשוב לציין, midgut יתוש, אשר ממלא תפקיד מרכזי הן בעיכול ארוחת דם וכניסה פתוגן, נמלים microbiome דינמי מאוד3.
מספר מחקרים אפיינו מיקרוביוטה יתושים שנצברה במעבדה ואספו בשדה בשיטה התלויה בתרבות אובחיידק רצף 4,5,6. מינים כמו פנטואה, סראטיה, קלבסילה, אליזבתקינגיה, ו Enterococcus מבודדים בדרך כללמיתושים במחקרים שונים 5,7,8,9. מעניין, microbiota מעיים יתוש תנודות באופן דינמי הן המגוון הקהילתי ואת כמות מינים חיידקים, מושפע שלב הפיתוח, מינים, מוצא גיאוגרפי, והתנהגותהאכלה 4. מחקרים מראים כי האכלת דם מגבירה באופן דרמטי את העומס החיידקי הכולל עם התרחבות מהירה של מינים מ Enterobacteriaceae וירידה במגוון הכולל 10,11. בנוסף, microbiota מעיים יתוש של שלב הזחל הוא בדרך כלל נמחק כאשר החרק עובר מטמורפוזה במהלך גורים ואקלוסיון; לכן, יתושים בוגרים חדשים צריכים לאכלס מחדש את המיקרוביוטהשלהם 4.
מיקרוביוטה מעיים לווסת פיזיולוגיה חרקים בהיבטים שונים, כולל ספיגת חומרים מזינים, חסינות, פיתוח, רבייה, ויכולתוקטורית 12. זחלי יתושים Axenic להיכשל לפתח מעבר instar הראשון בעוד חיידקים אוראלי אספקה מצילה את הפיתוח, המציין כי החיידק מעיים יתוש חיוני לפיתוחזחלים 13,14. חוץ מזה, דלדול של חיידקי מעיים מעכב את העיכול של ארוחת הדם וספיגת חומרים מזינים, משפיע על התבגרות ביציט, ומפחית oviposition15. בנוסף, יתושים עם מיקרופלורה במעיים לעורר תגובות חיסוניות גבוהות יותר בהשוואה יתושים שטופלו באנטיביוטיקה, עם ביטוי פפטיד מיקרוביאלי גבוה כל הזמן נגד פתוגנים אחריםלהדביק 16. אנטיביוטיקה ניתנת בדרך כלל דרך הפה כדי להסיר חיידקים מעיים פאן במחקרים אלה, ולאחר מכן נערכים ניסויים כדי להשוות את ההבדל בין יתושים axenic ויתושים עם חיידקים commensal. עם זאת, היתוש midgut נמלים קהילה מגוונת של חיידקים, וכל מין חיידקים יכול להפעיל השפעה ברורה כלפי הפיזיולוגיה המארחת.
מיקרוביוטה יתוש מווסת יכולת וקטורית עם השפעות שונות. קולוניזציה על ידי Proteus מבודד יתושים נגזר שדה של אזורים דנגה אנדמי מקנה ביטוי פפטיד מיקרוביאלית מפוקחת והתנגדות נגד זיהום וירוס דנגה16. הפטריה entomopathogenic Beauveria bassiana מפעילה את מסלול החיסון אגרה ו JAK-STAT נגד זיהום arbovirus17. לעומת זאת, הפטרייה Talaromyces מבודד Aedes aegypti midgut מקל על זיהום וירוס דנגה על ידי לווסת פעילות ניסיוןהמעיים 18. בנוסף, Serratia marcescens מקדם שידור arbovirus באמצעות חלבון הפרשה בשם SmEnhancin, אשר מעכל את שכבת הריר על אפיתל מעיים שליתושים 19.
הליך זה מספק שיטה שיטתית ואינטואיטיבית לניתוק של מידגוט היתושים, בידוד מושבות חיידקים הניתנות לפולחן, זיהוי מיני החיידקים והפעלה מחדש באמצעות האכלה אוראלית. הוא מספק תוצאות מייצגות של הזנת דם עם חיידק commensal, מנלינוספטיום Chryseobacterium, על התפתחות השחלות יתושים וoviposition.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים על אינטראקציות בין חיידקי מארחים מצאו כי מיקרובים שונים במעיים משפיעים על הפיזיולוגיה המארחת שלהם באמצעות מנגנונים שונים. מאמר זה מציג את השיטה לחקור את התפקיד המתאים של חיידקים מעיים יתוש, כולל ניתוח midgut יתוש, culturing חיידקים מעיים cultivable, טיפול אנטיביוטי, ו reintroducing חיידקים של עניין.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס’ 81902094, 81600497) ופרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של מחוז הונאן (2019RS1036).
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g； Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
