פרוטוקול זה מנסה לקבוע פרוטוקול חוזר עבור נוירונים ראשוניים ובידוד גליה מ שלפוחית השתן של חולדה לניסויים תאיים נוספים.
בדרכי השתן התחתונות יש שתי פונקציות עיקריות, כלומר, אחסון שתן תקופתי ומיקרוביום; פונקציות אלה מתווכים באמצעות נוירורגולציה מרכזית והיקפית. למרות מחקר מקיף על מערכת העצבים בדרכי השתן התחתונה נערך, רוב המחקרים התמקדו בתרבות העיקרית. פרוטוקול זה מציג שיטה לבידוד ותרבות של נוירונים בשלפוחית השתן וגליה מעכברושי ספראג-דוולי. בשיטה זו, הנוירונים וגליה היו דגירה ב 37 °C (60 °F), 5% CO2 חממה במשך 5-7 ימים. כתוצאה מכך, הם גדלו לצורות בוגרות המתאימות לניסויים הקשורים לכשל חיסוני. תאים נצפו מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופ אופטי. נוירונים, סינפטי סינפטי, גליה זוהו על ידי β-III-טובולין ו MAP-2, Synapsin-1, ו GFAP כתמים, בהתאמה. בינתיים, אימונוציטוכימיה בוצעה על מספר חלבונים הקשורים נוירוטרנסמיטר, כגון אצטילטרנספראז כולין, DYNLL2, ו SLC17A9.
לדרכי השתן התחתונות יש שתי פונקציות עיקריות: אחסון שתן תקופתי ומיקרוביום1. מערכת העצבים בדרכי השתן התחתונות (LUTNS) שולטת בתפקודים אלה והיא עדינה וראויה לנוירופתיות רבות, אשר יכול להיות מולד (פורפיריה), רכש (מחלת ליים), משני למצבי מחלה (ציסטופתיה סוכרתית), סמים המושרה (דלקת שלפוחית השתן דימומית), ניתוח שנגרם (כריתה abdominoperineal), או פציעה הנגרמת (פגיעה טראומטית בחוט השדרה)2,3,4,5,6,7. במחקרים פיזיולוגיים/פתולוגיים, ניסויים in vivo ו במבחנה חשובים באותה מידה. בעוד מחקר vivo על LUTNS נערך ברמות איברים, הסלולר, מולקולרית במשך זמן מה, אין ויטרו מחקר על נוירונים ראשוניים משלפוחית השתן הוא כמעט לא קיים8,9. למרות שהמחקר הנוכחי מוגבל, אנו מקווים ל החלוץ במחקר בתחום זה, כך שחוקרים אחרים יוכלו לשפר אותו. באופן זה, תרבות משותפת זו עלולה להוביל להבנה תאית של תפקוד לקוי פיזיולוגי בפנוטיפים, כגון תפקוד לקוי של נוירון שלפוחית השתן.
בניגוד לשרירים אנטריים עם כיווניות ברורה של תאי השריר לשכבות נפרדות, שרירי שלפוחית השתן אינם מאורגנים10. לכן, במקום לקלף את השכבה החיצונית של שלפוחית השתן, שיטה זו מציעה לעכל את שלפוחית השתן כולה כדי להפחית את קושי הפעולה ולקצר את זמן עיבוד מראש לשיעור הישרדות תאים גבוה.
בעקבות שיטה זו, אנו יכולים להשיג תרבות מעורבת של נוירונים ותאים אחרים. התאים האחרים הם הכרחיים כי נוכחותם מחקה סביבת vivo11. בנוסף, תאים כאלה מספקים את החומרים שאינם זמינים במדיום.
שיטה זו כוללת שני שלבים לעיכול. ראשית, קולגנאז מסוג II משמש הידרוליזה קולגן, ואחריו טריפסין, כדי לנתק את הרקמה לתאים10. באופן זה, רקמות שלפוחית השתן מפוזרות לתאים בודדים ולאחר מכן לגדול עצמאי יחסית. כאשר התרבות של נוירונים מתבגרת, הנוירונים יכולים לשמש להדמיה או מבחנים פונקציונליים.
הכנת צלחת
השימוש בכיסויי זכוכית בצלחות תרבות של 6, 12 או 48 בארות לניסויים אימונופלואורסצנטיים או הדמיית סידן הוא פעולה חסכונית וחוסכת מדגם. תאים גדלים היטב בצלחות ללא כיסויים במהלך הכנת תרביות תאים ראשוניות. לכן, כיסויים ניתנים לוותר בניסויים, כגון כתם מערבי או תגובת שרשרת פולימ?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס ‘ 81673676) ולשכת המדע והטכנולוגיה של דונגגוואן (גרנט מס ‘ 2019622101002). המחברים מודים לד”ר מרירוז סאליבן (פרופסור לכירורגיה, בית הספר לרפואה של הרווארד) על ייעוץ טכני.
0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |