Questo protocollo descrive un modello di infezione da Aspergillus nelle larve di zebrafish. Le spore di Aspergillus vengono microiniettate nel cervello posteriore delle larve e il trattamento chimico viene utilizzato per indurre l’immunosoppressione. La progressione dell’infezione viene monitorata tramite una configurazione giornaliera dell’imaging per monitorare la crescita fungina e le risposte immunitarie, nonché l’enumerazione delle spore vive mediante placcatura dell’unità di formazione della colonia.
L’aspergillosi invasiva (IA) è una delle infezioni fungine più comuni tra gli individui immunocompro compromessi. Nonostante la disponibilità di farmaci antifungini, L’IA può causare > 50% nei pazienti immunocomprotiti infetti. È fondamentale determinare sia i fattori ospiti che patogeni che contribuiscono alla suscettibilità alle infezioni e ai bassi tassi di sopravvivenza nei pazienti infetti al fine di sviluppare nuove terapie. Le risposte immunitarie innate giocano un ruolo fondamentale nel riconoscimento e nella clearance delle spore di Aspergillus, anche se poco si sa dei meccanismi cellulari e molecolari esatti. Sono necessari modelli affidabili per indagare le interazioni meccaniche dettagliate tra l’ospite e l’agente patogeno. La chiarezza ottica e la trattabilità genetica delle larve di zebrafish le rendono un modello intrigante per studiare le interazioni ospite-patogeno di infezioni batteriche e fungine umane multiple in un ospite vivo e intatto. Questo protocollo descrive un modello di infezione larvale del pesce zebra Aspergillus. In primo luogo, le spore di Aspergillus vengono isolate e iniettate nel ventricolo del ventricolo del cervello posteriore del pesce zebra tramite microiniezione. Quindi, gli inibitori chimici come i farmaci immunosoppressivi vengono aggiunti direttamente all’acqua larvale. Vengono descritti due metodi per monitorare l’infezione nelle larve iniettate, tra cui l’omogeneizzazione 1) delle larve per l’enumerazione dell’unità di formazione della colonia (CFU) e 2) una configurazione di imaging dal vivo ripetuta e giornaliera. Nel complesso, queste tecniche possono essere utilizzate per analizzare meccanicamente la progressione dell’infezione da Aspergillus in vivo e possono essere applicate a diversi background ospiti e ceppi di Aspergillus per interrogare le interazioni ospite-patogeno.
Aspergillus fumigatus è un onnipresente fungo saprofita e le sue spore trasportate dall’aria possono essere trovate sia all’interno che all’esterno1. Queste spore vengono inalato da tutti ma vengono efficacemente liberate dai polmoni degli individui immunocompetenti1,2. Tuttavia, le persone con condizioni polmonari alterate come la fibrosi cistica possono sviluppare aspergillosi broncopolmonare a causa della germinazione fungina nei polmoni3. La forma più grave di questa infezione, l’aspergillosi invasiva (IA), colpisce gli individui immunocompro compromessi e comporta la crescita del fungoin altri organi 2,3. L’IA > il 50% di morte di pazienti infetti nonostante la disponibilità di terapie antifungine4. Negli individui immunocompetenti, le risposte immunitarie innate svolgono un ruolo importante nello sgombero delle spore inalato1. Tuttavia, i meccanismi specifici che contribuiscono a questa innata clearance immunitaria non sono ben compresi. È importante comprendere i meccanismi cellulari e molecolari delle principali cellule immunitarie innate (cioè macrofagi e neutrofili) nella clearance di Aspergillus al fine di trovare nuove strategie terapeutiche per l’IA.
Mentre i modelli di mammiferi sono stati fondamentali per identificare i fattori di virulenza fungina e le risposte immunitarie dell’ospite5,6, l’accessibilità visiva è limitata per le interazioni ospite-patogeno a livello cellulare. Gli esperimenti di coltura tissutale non possono riassumere completamente il complesso ambiente multicellulare e le interazioni esistenti in interianimali 7. Pertanto, zebrafish ha guadagnato popolarità come organismo modello alternativo per colmare questa lacuna e facilitare lo studio delle interazioni ospite-patogeno in un ospite vivo e intatto attraverso un’infezione di piùgiorni 8,9. Il sistema immunitario innato zebrafish si sviluppa già 24 ore dopo la fecondazione (HPF)10e il sistema adattivo impiega 4-6 settimane per svilupparsi11, fornendo una finestra di tempo in cui le risposte immunitarie innate possono essere valutate isolatamente. Le risposte immunitarie innate sono ben conservate tra gli esseri umani e il pesce zebra11. Gli zebrafish hanno molte qualità che facilitano lo studio di queste risposte, tra cui la chiarezza ottica (che consente l’imaging dal vivo ad alta risoluzione di ospiti intatti) e la trattabilità genetica (che facilita gli studi meccanicistici molecolari).
Il modello di infezione larvale del pesce zebra Aspergillus descritto qui è stato originariamente sviluppato da Knox etal. Recentemente è stato ampliato dal nostro gruppo e da altri per indagare i meccanismi immunitari ospiti12,13,interazioni ospite-patogeno13,14,15,meccanismi di immunosoppressione13,16,17,virulenzafungina 18e efficacia del farmaco antifungino19,20. Questo modello riassume molteplici aspetti dell’aspergillosi umana. Mentre le larve immunocompetenti sono resistenti, le larve immunocomprotte possono soccombereall’infezione 12,13,16,17.
In questo modello, un’infezione localizzata viene stabilita iniettando spore nel ventricolo posteriore della larva, un’area meno popolata di fagociti e il reclutamento e il comportamento dei fagocitipossono essere valutati 12,13. Si ritiene che i macrofagi agiscano come la prima linea di difesa contro le spore di Aspergillus negliesseri umani 1 e i modelli di mammiferi6,21. Allo stesso modo, nel modello zebrafish, i macrofagi vengono reclutati nelle spore di Aspergillus iniettate, mentre i neutrofili vengono reclutati secondariamente in risposta alla crescita ifale12,13,22. Da questo modello, è stato anche appreso che Aspergillus può persistere nelle larve immunocompetenti di tipo selvatico dopo più di 7 giorni di infezione. Inoltre, l’intero decorso dell’infezione può essere seguito negli stessi animali vivi dall’imaging confocale quotidiano.
Questo protocollo descrive la tecnica della microiniezione per iniettare spore nel ventricolo del ventricolo del cervello posteriore di 2 giorni dopo la fecondazione (2 dpf) larve. L’infezione viene quindi monitorata per un massimo di 7 giorni, poiché le larve di zebrafish possono vivere fino a 10 dpf senza nutrirsi. L’immunosoppressione può essere indotta dal trattamento farmacologico e viene descritta anche l’applicazione di farmaci alle larve. Infine, vengono descritti due metodi per seguire la progressione dell’infezione, tra cui la quantificazione dei CFC da singole larve e una configurazione giornaliera di imaging dal vivo.
Il modello di infezione descritto qui è utile per analizzare le risposte immunitarie dell’ospite, le interazioni ospite-patogeno e la patogenesifungina 12,13,14,15. Queste informazioni possono essere derivate dall’imaging ad alta risoluzione di agenti patogeni con etichetta fluorescente e cellule ospiti13,sopravvivenza larvale e persistenza CFU nel tempo.
La tecnica di microiniezione è fondamentale per il successo di questo protocollo e potrebbe dover essere regolata quando si utilizzano diverse apparecchiature e configurazioni di microiniezione. In particolare, la pressione e il tempo di iniezione sono due variabili principali e possono essere regolati per garantire che il volume espulso dall’ago sia ~3 nL. La dimensione dell’ago determinata tagliandolo con pini regola anche il numero di spore iniettate; anche se, un’apertura più grande può causare danni ai tessuti alla larva. D’altra parte, troppo piccolo di un’apertura non consentirà alle spore relativamente grandi (>2 μm) di uscire e può portare all’intasamento dell’ago. In questo caso, l’ago può essere rifilato per avere un’apertura leggermente più grande.
Altri protocolli per la microiniezione di batteri utilizzano PVP-40 per aiutare a mantenere una miscela di iniezione omogenea, ma non abbiamo trovato alcun vantaggio nell’utilizzare questo vettore con spore aspergillus. L’intasamento dell’ago può essere mitigato vorticiando accuratamente la preparazione fungina per rompere eventuali grumi prima di caricare l’ago. A volte, un intasamento nell’ago può anche essere rimosso aumentando temporaneamente la pressione o il tempo di iniezione e innescando il microiniettore mentre l’ago si trova nel liquido che circonda le larve. La pressione e il tempo di iniezione devono quindi essere nuovamente ridotti ai livelli precedenti. In altri casi, un intasamento non può essere rimosso e un nuovo ago deve essere caricato e ricalibrato.
Questo protocollo è progettato per iniettare ~30-70 spore per larva. È noto che in base alla concentrazione della preparazione delle spore e al volume iniettato, questo numero è piuttosto basso. Tuttavia, è stato empiricamente scoperto che questo è il numero di spore iniettate in queste condizioni. Perché questa differenza si verifica è sconosciuta, ma potrebbe essere dovuta a spore che si raggruppano nell’ago. I nostri tentativi di iniettare un maggior numero di spore non hanno avuto successo.
Per garantire che vengano iniettate circa 30-70 spore e mantenere la consistenza delle iniezioni in tutte le larve, controllare il numero di spore iniettando sull’E3 che circonda le larve. Ripeti questo ogni cinque o sei larve durante tutte le iniezioni. Se il conteggio delle spore sembra cambiare, la pressione e / o il tempo di iniezione possono essere regolati per iniettare un numero coerente di spore su più larve. Tuttavia, si deve fare attenzione che la dose di iniezione rimanga principalmente nel cervello posteriore e non riempia il cervello medio e il forebrain.
Per garantire un’infezione localizzata, la sospensione della spora deve essere contenuta all’interno del ventricolo del ventricolo del cervello posteriore. Questo può essere visualizzato dalla colorazione rosso fenolo subito dopo l’iniezione, anche se il colore rosso si diffonde con il tempo. Per le iniezioni, la regione intorno alla vescicola otica viene utilizzata per perforare e raggiungere il ventricolo con un angolo di 45°-65°. Quest’area non ha vasi sanguigni principali, causa meno danni ai tessuti e guarisce all’istante. Se la pelle sopra il ventricolo viene perforata, la sospensione della spora può essere fuoriuscita, perché l’ago che deve essere utilizzato per le iniezioni di spore di Aspergillus è più grande di quello utilizzato per le sospensioni batteriche. Le larve iniettate o danneggiate accidentalmente senza successo possono essere contrassegnate iniettando nel tuorlo un paio di volte per creare un segno rosso o trascinando la larva fuori dalla fila con l’ago. Dopo che una serie di iniezioni è stata completata, queste larve devono essere rimosse e smaltite prima che il resto venga lavato via dal piatto. E3 senza blu di metilene viene utilizzato per anestetizzare le larve prima dell’iniezione e anche mantenere la larva dopo le iniezioni, perché il blu di metilene è anti-fungino.
Al momento dell’iniezione, i conteggi cfu rappresentano il numero di spore vitali all’interno dell’ospite infetto. Tuttavia, se le spore germinano in ife, queste possono essere suddivise in “unità fungine” vitali separate durante l’omogeneizzazione e possono dare origine a più colonie. Oppure, un’ifa multicellulare ininterrotta può dare origine a una singola colonia, risultando in una rappresentazione media, ma imprecisa, del fardello fungino. Questo può essere mitigato combinando i conteggi CFU con la microscopia longitudinale delle singole larve, che fornisce dati visivi sul destino delle spore iniettate.
Rispetto al sistema dei mammiferi, il modello di infezione della larva di zebrafish è particolarmente significativo grazie alla sua accessibilità ottica. Il reclutamento e la risposta delle cellule immunitarie innate possono essere visualizzati all’interno di un ospite intatto dal vivo. Questo può essere incorporato con l’inibizione genetica o chimica di obiettivi molecolari per analizzare come ogni bersaglio influisce sul macrofago o sulla reazione neutrofila contro le spore di Aspergillus in un animale vivo.
Mentre il modello di infezione della larva di zebrafish Aspergillus continua a essere strumentale nel descrivere diversi aspetti di IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22,ci sono altre aree di espansione. Dal lato ospite, viene utilizzato per descrivere le risposte immunitarie a livello cellulare, ma questo può essere espanso per analizzare i meccanismi immunitari a livello molecolare combinandolo con morfolino mirato, CRISPR, linee mutanti stabili o esposizione chimica. Un avvertimento è che gli omologhi per tutti i componenti noti della via immunitaria innata dei mammiferi non sono stati identificati nei pesci zebra.
Dal lato patogeno, è stata descritta la virulenza di diverse specie e ceppi. Una via promettente della ricerca futura è l’uso di ceppi mutanti di Aspergillus per testare come specifici geni o proteine contribuiscono come fattori di virulenza. In questo modo, nuovi farmaci anti-fungini possono essere sviluppati per colpire queste proteine. Gli attuali farmaci antifungini hanno una bassa efficacia nei pazienti umani e c’è una crescente resistenza a questi farmaci nei funghi28. Questo modello in vivo può essere utilizzato per indagare perché questi farmaci falliscono e come modello intermedio per testare l’efficacia di nuovi farmaci antifungini. Nel complesso, i risultati scoperti utilizzando questo modello possono facilitare lo sviluppo futuro di trattamenti efficaci per i pazienti infetti da Aspergillus.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Allergy And Infectious Diseases del National Institutes of Health con il premio K22AI134677. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.
Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose | Fisher | BP160-500 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
Media and Solutions | Components/Recipe | ||
E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |