Modelliamo un semplice test ECL multiplex che combina 7 saggi di autoanticorpi insieme. Il test è in grado di eseguire lo screening per il T1D e molte altre malattie autoimmuni, contemporaneamente, tra cui la celiachia, la malattia autoimmune della tiroide e la sindrome polighiandolare autoimmune 1.
Gli autoanticorpi delle isole (IAbs) sono ampiamente utilizzati nella diagnosi e nella previsione del diabete di tipo 1 (T1D). Quattro principali IAb all’insulina (IAA), glutammato decarbossilasi-65 (GADA), insulinoma antigene-2 (IA-2A) e trasportatore di zinco-8 (ZnT8A) sono ugualmente importanti nella previsione della malattia. Attualmente, fino al 40% dei pazienti con diagnosi di T1D continua a sviluppare altri disturbi autoimmuni. Sfortunatamente, gli attuali metodi di screening che utilizzano un singolo autoanticorpo per la misurazione sono laboriosi e inefficienti per studi di screening su larga scala. Recentemente abbiamo sviluppato un semplice test di elettrochemiluminescenza multipla (ECL) per affrontare questi problemi attuali. Il test combina tutti e 7 i test degli autoanticorpi in un unico pozzetto. Ogni pozzetto include tre IAb (IAA, GADA e IA-2A), autoanticorpi contro la perossidasi tiroidea (TPOA) e la globulina tiroidea (ThGA) per rilevare la malattia autoimmune della tiroide, autoanticorpi contro la transglutaminasi tissutale (TGA) per la celiachia e autoanticorpi contro l’interferone alfa (IFNαA) per la sindrome polighiandolare autoimmune-1 (APS-1); tutti i quali schermano il T1D e altre malattie autoimmuni rilevanti, contemporaneamente. Il test ECL multiplex si basa sulla singola piattaforma di analisi ECL, ma utilizza invece la piastra multiplex che combina più saggi autoanticorpali, fino a 10, in un singolo pozzetto. La principale differenza rispetto al singolo test ECL è che ogni complesso anticorpo-antigene formato nella fase fluida viene trattenuto su un punto specifico su ciascun pozzetto attraverso un sistema linker sulla piastra multiplex. Il test ECL 7-Plex, nel presente studio, è convalidato rispetto ai saggi standard di radio-legame (RBA) e ai singoli saggi ECL, utilizzando un’ampia coorte di pazienti T1D di nuova diagnosi e controlli sani di pari età, con conseguente eccellente sensibilità e specificità del test.
Il diabete di tipo 1 (T1D) è una grave malattia cronica che è più comune durante l’infanzia. Attualmente, circa 1,4 milioni di persone hanno il T1D negli Stati Uniti; sorprendentemente, l’incidenza del T1D è in costante aumento del 3-5% ogni anno in tutto il mondo ed è raddoppiata negli ultimi due decenni, specialmente nei bambini piccoli 1,2. Gli autoanticorpi delle isole (IAbs) nella circolazione sanguigna sono attualmente il biomarcatore più affidabile. Gli IAbs possono comparire anni prima che il T1D clinico si sviluppi3. Attualmente, quattro principali IAb sono ampiamente utilizzati nella diagnosi di T1D e nello screening del rischio, tra cui gli autoanticorpi contro l’insulina (IAA), la glutammato decarbossilasi-65 (GADA), l’antigene dell’insulinoma-2 (IA-2A) e il trasportatore di zinco-8 (ZnT8A). Questi quattro IAb sono ugualmente importanti nella previsione dello sviluppo di T1D. La classificazione del T1D è stata recentemente ridefinita come la presenza di ≥2 di ogni 4 IAb con un normale metabolismo del glucosio come stadio della malattia 14.
Nel Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY), è stato rivelato che un bambino su quattro a rischio di T1D aveva probabilità di progredire verso l’autoimmunità delle isole, della celiachia, della tiroide o reumatoide e, cosa più sorprendente, circa il 40% dei pazienti a cui è stato diagnosticato il T1D alla fine sviluppa un’ulteriore condizione autoimmune 5,6,7 . L’identificazione degli autoanticorpi è essenziale per la previsione e la diagnosi di queste malattie autoimmuni e dovrebbe fornire una migliore assistenza clinica ai pazienti. Al momento non esiste un modo semplice ed economico per lo screening di queste molteplici condizioni autoimmuni. Gli attuali metodi di screening che utilizzano il saggio standard di radio-legame (RBA), con una singola misurazione degli autoanticorpi, sono laboriosi e inefficienti per uno screening su larga scala.
Qui, descriveremo il test ECL multiplexato semplice di nuova concezione, che abbiamo autenticato utilizzando una singola piattaforma di analisi ECL 8,9,10,11. Il test ECL multiplex combina 7 test autoanticorpali in un unico pozzetto, utilizzando solo 15 μL di siero, ed è in grado di eseguire lo screening per T1D e più malattie autoimmuni rilevanti contemporaneamente tra cui celiachia, malattia autoimmune della tiroide e APS-1. Un test ECL ZnT8A non era stato sviluppato al momento e non è stato incluso nel test multiplexato. Il test ECL multiplex fornisce uno strumento eccellente per l’elevata produttività nello screening della popolazione generale per T1D e malattie autoimmuni multiple.
In numerosi studi clinici nazionali e internazionali per il diabete di tipo 1, le prestazioni del singolo saggio ECL per rilevare gli autoanticorpi delle isole e gli autoanticorpi alla transglutaminasi (TGA) per la celiachia, sono state confermate 8,9,10,11. Nel corso di queste tracce, questo test ha aumentato la sensibilità e la specificità per il rilevamento dell’autoantigene quando valutato rispetto all’attuale RBA “gold” standard. La maggiore specificità della malattia può essere vista quando si discriminano gli autoanticorpi delle isole ad alta affinità e ad alto rischio da segnali a basso rischio e bassa affinità, tra il singolo test ECL e la RBA14,15,16,17. Sulla base del singolo test ECL, presentiamo un nuovo test di autoanticorpi ECL multiplex ad alto rendimento, per consentirci di eseguire lo screening del T1D e di diverse malattie autoimmuni applicabili allo stesso tempo.
Il test ECL multiplex utilizza la piastra multiplex, che può combinare fino a 10 saggi di autoanticorpi in un unico pozzetto. Per il presente studio, 7 saggi di autoanticorpi sono combinati insieme. Gli autoanticorpi comprendono 3 IAb (IAA, GADA e IA-2A), 2 autoanticorpi per la malattia autoimmune della tiroide (TPOA e ThGA), autoanticorpi per la celiachia (TGA) e autoanticorpi APS-1 contro l’interferone alfa (IFNαA). Il meccanismo di analisi è, in generale, basato su un singolo test ECL come precedentemente pubblicato 9,10,12,18 con alcune modifiche. La principale differenza di un test ECL multiplex da un singolo test ECL è che ogni complesso anticorpo-antigene formato nella fase fluida è vincolato a un linker specifico (Figura 1). L’antigene marcato con biotina viene incubato con la streptavidina coniugata, un linker utilizzato per formare uno specifico complesso antigene-linker. Il complesso immunitario anticorpo-antigene si forma dopo l’incubazione con il siero del paziente e viene catturato in un punto specifico attraverso il sistema di linker specifico su ciascun pozzetto della piastra multiplex. L’antigene marcato Ru Sulfo-NHS catturato dagli anticorpi allo stesso tempo fornisce il segnale con elettrochemiluminescenza. La macchina lettore di piastre può rilevare fino a 10 segnali diversi dalle sorgenti spot situate in ciascun pozzetto. Per mantenere i test degli autoanticorpi coerenti tra le piastre e durante la conduzione di studi a lungo termine, suggeriamo di utilizzare lo stesso linker.
Prima di impostare un test ECL multiplex, i singoli saggi ECL per ciascun autoanticorpo devono essere ottimizzati su una piastra multiplex, rispettivamente, e convalidati sia rispetto ai test RBA che a quelli ECL singoli su una piastra ECL regolare. Per migliorare il test a scacchiera, al relativo test di autoanticorpi sulla piastra multiplex, sono stati utilizzati un campione di paziente altamente positivo e un campione di paziente negativo. Dopo che è stato condotto il test a scacchiera, le concentrazioni più ideali per Ru Sulfo-NHS e l’antigene marcato con biotina sono state calcolate per ciascuno dei 7 saggi di autoanticorpi. Quanto segue mostra queste concentrazioni: 30 ng/mL e 200 ng/mL per GAD65, 120 ng/mL e 120 ng/mL per la proinsulina, 10 ng/mL e 42 ng/mL per IA-2, 80 ng/mL e 80 ng/mL per TG, 8 ng/mL e 16 ng/mL per TPO, 31 ng/mL e 31 ng/mL per ThG, e 12 ng/mL e 12 ng/mL rispettivamente per IFNα13. Potrebbe essere necessario regolare ulteriormente le concentrazioni di alcuni degli antigeni del test a scacchiera in base ai risultati del test multiplex effettivo dopo aver combinato tutti i test insieme.
Poiché l’IAA è inclusa nel presente test ECL multiplex, il trattamento acido dei campioni di siero è obbligatorio prima di incubare il siero con l’antigene, come riportato nel precedente studio12. Generalmente, quando un autoanticorpo extra viene aggiunto a un test multiplex, lo sfondo del test è influenzato e un segnale estremamente alto da un punto, nel pozzo, può ostruire i risultati dei punti vicini tramite diafonia. Pertanto, il CPS massimo deve essere limitato a 20.000 conteggi per ciascun autoanticorpo, o inferiore, per i campioni positivi più alti. Dalle nostre conoscenze, al fine di ridurre la quantità di diafonia coinvolta, gli autoanticorpi che hanno uno sfondo inferiore dovrebbero essere separati, quando si progetta la mappa spot, lontano dai punti con una maggiore frequenza di conteggi.
Elevati controlli positivi e negativi sono stati utilizzati internamente in ogni test per calcolare un indice accurato per i campioni sconosciuti sottoposti a test. Per valutare e monitorare accuratamente la sensibilità del test, sono stati utilizzati controlli positivi bassi, impostati vicino al limite superiore del test. Questi controlli standard positivi e negativi sono stati creati in blocco e in aliquote per uso a lungo termine e conservati a -20 °C o meno, per coerenza tra i saggi. Ai fini della garanzia della qualità, i campioni sono stati eseguiti due volte in ogni test e ogni risultato positivo è stato rieseguito e confermato eseguendo il campione in un nuovo test ECL il giorno successivo. In caso di disaccordo con il primo e il secondo test di conferma, era necessario un terzo test. Dei tre test condotti, i risultati dei due test che concordano (ad esempio, +, + o -,-), hanno determinato il risultato finale (positivo o negativo) del campione.
Nell’ultimo decennio, molti gruppi di studio stanno cercando un test ad alto rendimento utilizzando il metodo multiplex per combinare più saggi autoanticorpali insieme in un unico pozzo per lo screening di grandi popolazioni. Ci sono alcuni studi che utilizzano diversi tipi di tecnologie per condurre saggi di autoanticorpi multiplex 19,20,21,22, ma non c’è confronto per nessuno di questi test in sensibilità e specificità rispetto all’attuale RBA “gold” standard, quando si studia T1D. Questi diversi tipi di piattaforme utilizzate non sono convalidate attraverso il workshop internazionale Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) o attraverso test di grandi coorti in studi clinici. In un recente screening generale basato sulla popolazione in Germania, un test combinato ad alto rendimento, 3 Screen ICATM ELISA distribuito da Kronus, viene utilizzato come strumento per lo screening di prima linea per rilevare tre IAb, GADA, IA-2A e ZnT8A, per ottenere una diagnosi precoce del T1D23 infantile. Il test ELISA a 3 schermi misura 3 autoanticorpi in 3 pozzetti separati, consumando un grande volume di siero, o in un singolo pozzetto con tutti e 3 i saggi miscelati. Se un pozzetto nel test ELISA a 3 schermi è positivo, non si è in grado di distinguere quale dei tre autoanticorpi è presente. Il più grande svantaggio di questo test è la sua incapacità di includere la misurazione IAA. Tutti i risultati IAA eseguiti da ELISA, come dimostrato nei workshop IASP, non hanno una sensibilità e specificità accettabili24. IAA è di solito il primo IAb a comparire e ha un’alta prevalenza tra i bambini piccoli. Lo screening IAb, con IAA, è necessario per i bambini e non è ritenuto accettabile condurre questo screening senza IAA per valutare il rischio di T1D nella comunità. Inoltre, non ci sono studi o dati pubblicati che dimostrino che il test del kit Kronus IAb sia più specifico per la malattia T1D e in grado di discriminare IAb ad alto rischio da IAb a basso rischio. Il test ECL 7-Plex, nel presente studio, è stato convalidato utilizzando un’ampia coorte di pazienti di nuova diagnosi conT1D 13. Rispetto all’attuale RBA standard e al consolidato test ECL singolo, il test 7-Plex è in grado di mantenere il 100% di positività con la stessa specificità del test (Tabella 4). Attualmente, il test 4-Plex ECL, parallelo allo standard RBA, viene applicato a un ampio studio clinico in corso: lo studio Autoimmunity Screening for Kids (ASK). Questo studio esamina i bambini nella popolazione generale, dell’area metropolitana di Denver, per T1D e celiachia. Rispetto all’RBA standard utilizzato nello studio ASK, il test ECL multiplex sta mostrando un’eccellente sensibilità e una maggiore specificità della malattia, identica ai nostri precedenti rapporti utilizzando il singolo studio ECL25. Inoltre, il nostro test ECL 4-Plex ha dimostrato una marcata riduzione del travaglio, dei costi e del volume sierico del 70%, rispetto ai corrispondenti 4 test singoli per ECL e RBA. Utilizzando il test ECL multiplexato, possiamo personalizzare ogni pozzetto con numeri diversi, che rappresentano diversi autoanticorpi (fino a 10), per testare diverse malattie autoimmuni specifiche per le esigenze di una particolare sede clinica.
Ci sono alcune limitazioni osservate, mostrate nel presente studio, per un test ECL multiplex utilizzando la piastra multiplex. La diluizione finale del siero, incubato con antigene, non può essere regolata per produrre le condizioni ottimali per ogni singolo test di autoanticorpi combinato in un singolo pozzetto. Nove campioni (9/1026), da pazienti T1D, sono stati osservati per avere un risultato falso negativo per particolari autoanticorpi. 7 dei falsi negativi erano per TPOA e 2 erano per ThGA, nel test 7-Plex ECL, ma sono stati esposti risultati positivi sia nel singolo test ECL che nella RBA (Figura 2 e 3). Dopo un’ulteriore diluizione di tutti e 9 i campioni, sono diventati positivi sulla piastra multiplex. Questo risultato è causato da quello che descriviamo come il fenomeno “prozona”. Questo fenomeno fa sì che il campione mostri un risultato falso negativo perché gli alti titoli anticorpali stanno influenzando la formazione dei reticoli antigene-anticorpo. Quando si imposta un test multiplex, si raccomanda di eseguire campioni con titoli molto elevati, per ciascuno degli autoanticorpi combinati, per eseguire test preliminari per identificare la diluizione facoltativa del siero per l’incubazione dell’antigene. In alternativa, devono essere selezionati saggi di autoanticorpi con condizioni ottimizzate simili per formare un test combinato da cui si ottiene la migliore sensibilità e specificità del saggio per ciascun autoanticorpo. Nel presente studio, 7 campioni (7/1022), da controlli normali sani, hanno determinato falsi positivi per più autoanticorpi nel test 7-Plex, ma dopo aver eseguito un singolo test ECL e RBA (Figura 2 e 3) questi autoanticorpi sono risultati negativi in entrambi i test. Le ragioni alla base di questi risultati falsi positivi che si verificano sulla piastra multiplex, per questo piccolo sottoinsieme di campioni, sono attualmente sconosciute. Per l’applicazione corrente del test ECL multiplex, tutti i campioni positivi vengono ripetuti con il loro corrispondente test ECL singolo per confermare la positività, che rimuove questo errore falso positivo dal test ECL multiplex.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH DK32083, JDRF Grants 2-SRA-2015-51-Q-R e 2-SRA-2018-533-S-B.
4 °C refrigerator | |||
–80 °C and -20 °C freezers | |||
96-well Plate Shaker | Wallac – Delfi | ||
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Acetic acid solution | Fisher | ||
Aluminum foil | |||
Antigen proteins | |||
Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
Human ThG full length protein | BioMart | ||
Human TPO full length protein | BioMart | ||
IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
IFN-α protein | Abcam | ||
Proinsulin protein | AmideBio | ||
tTG protein | DiaRect | ||
Biotin | Sigma | ||
Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
Distilled deionized (DD) water | |||
HCl | Fisher | ||
Ice maker | |||
Ice trays | |||
MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
Multi-channel pipette | |||
NaOH | |||
Paper tower | |||
PBS | |||
pH meter | |||
Pipette-Aid | |||
Pipettes/tips | |||
Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
Uplex Development Kit | MSD | ||
96-well UPlex plate | MSD | ||
Blocker A | MSD | R93AA | |
Linker-Streptavidin | MSD | ||
Read buffer | MSD | R92TC | |
Stop Solution | MSD | ||
Vortex mixer | |||
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