Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

Summary

Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

Abstract

A dobra correta e a montagem de proteínas e complexos proteicos são essenciais para a função celular. As células empregam vias de controle de qualidade que corrijam, sequestram ou eliminam proteínas danificadas para manter um proteome saudável, garantindo assim proteostase celular e prevenindo danos adicionais à proteína. Devido a funções redundantes dentro da rede de proteostase, a triagem de fenótipos detectáveis usando knockdown ou mutações em genes codificadores de acompanhantes no organismo multicelular Caenorhabditis elegans resulta na detecção de fenótipos menores ou não na maioria dos casos. Desenvolvemos uma estratégia de triagem direcionada para identificar acompanhantes necessários para uma função específica e, assim, preencher a lacuna entre fenótipo e função. Especificamente, monitoramos interações de acompanhantes novos usando telas de interação sintética RNAi, expressão de acompanhante, um acompanhante de cada vez, em animais carregando uma mutação em um gene codificante de acompanhantes ou expressando demais um acompanhante de interesse. Ao interromper dois acompanhantes que individualmente não apresentam fenótipo bruto, podemos identificar acompanhantes que agravam ou expõem um fenótipo específico quando ambos perturbados. Demonstramos que essa abordagem pode identificar conjuntos específicos de acompanhantes que funcionam juntos para modular a dobra de um complexo de proteínas ou proteínas associados a um determinado fenótipo.

Introduction

As células lidam com danos proteicos empregando máquinas de controle de qualidade que reparam, sequeram ou removem quaisquer proteínas danificadas^1,2. O dobrável e a montagem de complexos proteicos são suportados por acompanhantes moleculares, um grupo diversificado de proteínas altamente conservadas que podem reparar ou sequestrar proteínas danificadas^3,4,5,6,7. A remoção de proteínas danificadas é mediada pelo sistema ubiquitina-proteasome (UPS)⁸ ou pelo maquinário de autofagia⁹ em colaboração com acompanhantes^10,11,12. A homeostase proteica (proteostase) é, portanto, mantida por redes de controle de qualidade compostas por máquinas dobráveis e degradantes^3,13. No entanto, entender as interações entre os diversos componentes da rede de proteostasis in vivo é um grande desafio. Enquanto as telas de interação proteína-proteína contribuem com informações importantes sobre interações físicas e complexos de acompanhantes^14,15, falta compreender a organização e mecanismos compensatórios dentro de redes de acompanhantes específicas do tecido in vivo.

As interações genéticas são frequentemente usadas como uma ferramenta poderosa para examinar a relação entre pares de genes que estão envolvidos em vias biológicas comuns ou compensatórias^16,17,18. Tais relações podem ser medidas combinando pares de mutações e quantificando o impacto de uma mutação em um gene sobre a gravidade fenotípica causada por uma mutação no segundo gene¹⁶. Embora a maioria dessas combinações não demonstre efeito em termos de fenótipo, algumas interações genéticas podem agravar ou aliviar a gravidade do fenótipo medido. Mutações agravantes são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é mais grave do que o fenótipo esperado visto ao combinar os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes funcionam em caminhos paralelos, afetando juntos uma determinada função. Em contraste, mutações aliviadas são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é menos grave do que o fenótipo visto com os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes agem juntos como um complexo ou participam da mesma via^16,18. Assim, diversos fenótipos que podem ser quantificados, incluindo fenótipos amplos, como letalidade, taxas de crescimento e tamanho de ninhadas, bem como fenótipos específicos, como repórteres transcricionais, têm sido usados para identificar interações genéticas. Por exemplo, Jonikas et al. contaram com um repórter de estresse do PS para examinar as interações do Saccharomyces cerevisiae ER desdobrado rede de proteostase de resposta à proteína usando análises de exclusão genética de pairwise¹⁹.

As telas de interação genética envolvem cruzar sistematicamente mutações de exclusão pares para gerar um conjunto abrangente de mutantes duplos²⁰. No entanto, em modelos animais, e especificamente em C. elegans,essa abordagem em larga escala não é viável. Em vez disso, cepas mutantes podem ser testadas para seus padrões de interação genética através da expressão genética de baixa regulação usando a interferência de RNA (RNAi)²¹. C. elegans é um poderoso sistema para telas baseados em RNAi^22,23. Em C. elegans,a entrega de RNA (dsRNA) de duplar encalha é alcançada pela alimentação bacteriana, levando à disseminação de moléculas de dsRNA para numerosos tecidos. Dessa forma, as moléculas de dsRNA introduzidas impactam o animal através de um procedimento rápido e simples²¹. Uma tela de interação genética usando RNAi pode, portanto, revelar o impacto da regulação de um conjunto de genes ou da maioria dos genes codificadores C. elegans usando bibliotecas RNAi²⁴. Em tal tela, hits que impactam o comportamento do mutante de interesse, mas não a cepa do tipo selvagem são modificadores potenciais do fenótipo sendo^{monitorados 25}. Aqui, aplicamos uma combinação de mutações e triagem RNAi para mapear sistematicamente interações de acompanhantes específicas de tecidos em C. elegans.

Protocol

1. Preparação de placas de mídia de crescimento de nematoide para RNAi A uma garrafa de 1 L, adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptone, 17 g de ágar e água destilada até 1 L e autoclave. Frie a 55 °C. Adicione 25 mL de 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4e 1 mL de solução decolesterol (Tabela 1) para fazer mídia de crescimento nematode (NGM). Adicione 1 mL de ampicilina (100 mg/mL) e 0,5 m…

Representative Results

Usando mutações sensíveis à temperatura no UNC-45 para testar para agravar ou aliviar interações em condições permissivas ou restritivas, respectivamenteA montagem e manutenção muscular oferecem um sistema eficaz para estudar interações de acompanhantes específicas do tecido. A unidade funcional de músculos contratuais, o sarcomere, apresenta um arranjo cristalino de proteínas estruturais e regulatórias. A estabilidade da miose da proteína motora e sua incorporação nos filamentos e…

Discussion

Uma imagem integrada da rede de proteostase refletindo como ela é organizada e funciona em diferentes células metazoanas e tecidos permanece em falta. Para supridamente essa deficiência, são necessárias informações específicas sobre as interações de diversos componentes dessa rede, como acompanhantes moleculares, em tecidos específicos durante o desenvolvimento e envelhecimento. Aqui, mostramos como o uso de perturbações específicas do tecido nos permitiu examinar a rede de acompanhantes em um determinado t…

Materials

12-well-plates	SPL	BA3D16B
40 mm plates	Greiner Bio-one	627160
60 mm plates	Greiner Bio-one	628102
6-well plates	Thermo Scientific	140675
96 well 2 mL 128.0/85mm	Greiner Bio-one	780278
Agar	Formedium	AGA03
Ampicillin	Formedium	69-52-3
bromophenol blue	Sigma	BO126-25G
CaCl2	Merck	1.02382.0500
Camera	Qimaging	q30548
Cholesterol	Amresco	0433-250G
Confocal	Leica	DM5500
Filter (0.22 µm)	Sigma	SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ165FC
Glycerol	Frutarom	2355519000024
IPTG	Formedium	367-93-1
KCl	Merck	104936
KH2PO4	Merck	1.04873.1000
KOH	Bio-Lab	001649029100
MgSO4	Fisher	22189-08-8	Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody	Hybridoma Bank	5-6
Na2HPO4·7H2O	Sigma	s-0751
NaCl	Bio-Lab	001903029100
Peptone	Merck	61930705001730
Plate pouring pump	Integra	does it p920
RNAi Chaperone library	NA	NA
SDS	VWR Life Science	0837-500
ß-mercaptoethanol	Bio world	41300000-1
stereomicroscope	Leica	MZ6
Tetracycline	Duchefa Biochemie	64-75-5
Tris	Bio-Lab	002009239100
Tween-20	Fisher	BP337-500