Summary

リアルタイム細胞解析を用いた宿主外でのインフルエンザウイルスの生存率のモニタリング

Published: February 20, 2021
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Summary

ここで報告されるのは、感染細胞の電気インピーダンスのリアルタイムモニタリングを用いた感染性ウイルス粒子の定量化のためのプロトコルである。この方法の実用的な応用は、環境条件を模倣する異なる物理化学的パラメータ下でのインフルエンザA型ウイルス崩壊を定量化することによって提示される。

Abstract

ウイルス粒子定量のための方法は、多くのウイルス学研究の重要な側面を表しています。いくつかの信頼できる手法が存在しますが、時間がかかるか、小さな変動を検出できません。ここでは、感染細胞の電気インピーダンス変動をリアルタイムで分析することにより、ウイルス力価を正確に定量化するためのプロトコルを紹介します。細胞インピーダンスは、マイクロプレートの細胞の下に位置する金の微小電極バイオセンサを介して測定され、その大きさは細胞の数およびそのサイズおよび形状に依存する。このプロトコルにより、細胞増殖、生存率、形態、および遊走のリアルタイム分析が高感度で可能になります。また、ウイルス感染力に経時的に影響を与える様々な物理化学的パラメータ(すなわち、温度、塩分濃度、pH)に服従するインフルエンザA型ウイルス(IAV)の崩壊を定量化することによって、実用化の例を提供する。このようなアプリケーションの場合、このプロトコルは必要な作業負荷を軽減しながら、感染性ウイルス粒子の正確な定量データを生成します。これにより、異なるIAV間の不活性化スロープの比較が可能になり、特定の環境で持続する能力が反映されます。このプロトコルは、実行が容易であり、再現性が高く、細胞培養において細胞変性効果を産生するあらゆるウイルスに適用することができる。

Introduction

ウイルスの伝播は、いくつかの要因の組み合わせに依存します。環境内で分泌されるウイルスの場合、その感染は、宿主外の条件下で持続する能力にも依存します。したがって、ウイルスの不活性化全般を研究することは、国家保健当局や政策立案者が管理およびバイオセーフティ対策を実施するのに役立つ重要なステップです。

自然環境および実験室環境におけるウイルスの持続性に関する知識は、過去10年間で大幅に増加しました。インフルエンザA型ウイルス(IAV)の場合、その感染経路はウイルス粒子を広範囲の環境条件に服従させる。具体的には、それらは、1)水(すなわち、鳥ウイルス)を通る糞便 – 経口経路、または2)汚染されたフォマイト、ならびにエアロゾルおよび呼吸飛沫(すなわち、家禽および哺乳動物ウイルス)による直接的または間接的な接触を介して伝達され得る1。いずれにせよ、IAVは様々な物理化学的パラメータ(すなわち、pH、塩分濃度、温度、湿度)に服従し、それらは多かれ少なかれそれらの感染力に急速に影響する23456789特に人獣共通感染症ウイルスやパンデミックウイルスに関しては、ウイルスの動態に影響を与える環境要因の可能性、曝露および種間伝播のリスクを評価することが非常に重要です。

これまでのところ、従来のウイルス学技術(すなわち、プラークアッセイまたは50%組織培養感染用量推定によるウイルス力価決定)は、IAV感染力を経時的に評価するために使用されてきた。しかし、これらの技術は時間がかかり、多くの消耗品を必要とします10,11,12。微小電極を用いて感染細胞のインピーダンスを経時的に測定することは、さまざまな環境条件下でのIAV生存、および一般的なウイルス不活性化を監視するための有用なツールとして役立ちます。この方法は、細胞変性効果の主観的なヒト観察に代わる客観的でリアルタイムのデータを提供する。ウイルス滴定の決定に使用できるため、従来の測定を低い信頼区間に置き換え、労働集約的なエンドポイントアッセイを回避できます。

細胞インピーダンスの測定と古典的なプラークアッセイまたはTCID50法によって得られた滴定結果との間には線形相関が存在する。したがって、インピーダンスベースの滴定法で得られたデータは、ウイルスの段階希釈による標準曲線を作成することでTCID50またはpfu値に容易に変換することができます13,14,15,16,17。血清サンプル中に存在する中和抗体の検出、定量、および有効性も、この実験的アプローチを用いて達成することができる18,19。最近では、インピーダンスベースの細胞アッセイが、Equid alphaherpesvirus20に対する抗ウイルス化合物のスクリーニングおよび評価に使用されています。

この技術は、異なる温度での生理食塩水中のIAVの持続性を評価し、環境中のIAVの持続性を増減させるIAVのヘマグルチニンの変異を特定するために使用されてきました21。このようなスクリーニングは、従来の滴定法を使用する場合、広範な作業を必要とするであろう。しかし、この方法論は、細胞形態、細胞数、および細胞表面付着強度に影響を与える任意のウイルスに使用することができる。また、さまざまな環境条件(空気中、水中、または表面)での持続性を監視するためにも使用できます。

ここで説明するプロトコルは、例として水中でのIAV生存を適用します。ヒトインフルエンザウイルスは、長期間にわたって異なる物理化学的パラメータに曝露される。35°Cの生理食塩水(35g/L NaCl)を環境モデルとして選定した9。暴露されたウイルスの残留感染力は、細胞感染を介して異なる時点で定量化される。IAV増幅の基準細胞型であるMDCK細胞を、マイクロ電極センサーでコーティングした16ウェルマイクロタイタープレート上に播種し、24時間後に暴露されたウイルスに感染させた。セルインピーダンスは15分ごとに測定され、セルインデックス(CI)と呼ばれる任意の単位として表されます。インフルエンザウイルスによって誘導される細胞変性効果は、その発症速度が細胞培養物に接種された感染性ウイルス粒子の数に直接依存し、CI減少をもたらし、続いてCIT50値として定量化される。この値は、初期CIからの50%の減少を測定するのに必要な時間(すなわち、ウイルス添加前)に対応する。いくつかの環境暴露時間について計算されたCIT50値は、CIT50値の線形回帰後のウイルスの不活性化傾きの控除を可能にする。

Protocol

すべてのインフルエンザウイルスを適切なバイオセーフティレベルの要件(サブタイプに応じてBSL-2以上)に従って処理します。継代履歴が低いIAV株(MDCK細胞では5倍未満)を使用して、実験間の変動が少ないことを保証します。 1. 試薬および出発物質の調製 MDCK細胞及び滅菌細胞培養培地の調製 10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)および抗生物質(100単位/mLペニシリン、…

Representative Results

異なる濃度のMDCK細胞を用いて120時間後に得られた生データを、ウェル当たり15,000〜120,000細胞から、 図1に示す。24時間後、CI測定は、30,000個の細胞を播種したウェル内の細胞がまだ増殖の指数関数的な段階にあり、この細胞濃度をさらなる実験に使用したことを示している。 図2 は、CIT50 値と感染の初期多重度との間の線形相関を示す。MDC…

Discussion

RTCAはインピーダンスベースの技術で、細胞の接着、増殖、遊走、細胞毒性などの細胞特性のリアルタイムモニタリングにますます使用されています。本研究では、宿主外でのIAV生存率を評価するこの技術の能力は、ウイルスの不活化勾配を測定することによって実証される。TCID50やプラークアッセイなどの厳格な技術は、細胞生存率の客観的なリアルタイム評価に置き換えられ、ウ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

0.25%Trypsin ThermoFisher 25200056
75 cm2 tissue culture flask Falcon 430641U
E-Plate 16 (6 plates) ACEA Biosciences, Inc 5469830001 E-plates are avalible in different packaging
FCS Life technologies (gibco) 10270-106
MEM 1X Life technologies (gibco) 31095029
PBS 1X Life technologies (gibco) 14040091
Penicillin-Streptomycin Life technologies (gibco) 11548876
TPCK-Trypsin Worthington LS003740
xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 ACEA Biosciences, Inc 380601310 The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)

References

  1. Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
  2. Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
  3. Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
  4. Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
  5. Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
  6. Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
  7. Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
  8. Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
  9. Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
  10. Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
  11. Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
  12. Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
  13. Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
  14. Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
  15. Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
  18. Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
  19. Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
  20. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  21. Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
  22. Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).

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Cite This Article
Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J., Leclercq, I. Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (168), e61133, doi:10.3791/61133 (2021).

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