Flypub测定测量果蝇在乙醇影响下表现出的行为。该测定很容易被各级的实验者掌握,并应用于各种蒸发刺激,促进药物滥用和成瘾研究。
酒精使用障碍(AUD)仍然是我们社会的一个严重问题。为了制定有效的成瘾干预措施,必须了解潜在的神经生物学机制,为此需要不同的实验方法和模型系统。酒精饮料的主要成分是乙醇,它导致中枢神经系统的适应性变化和慢性摄入时的行为。行为敏感性(即反应升级)尤其代表了成瘾背后的一个关键适应性变化。动物模型中大多数由乙醇引起的行为敏感研究都对乙醇的驱动作用进行了研究。乙醇的一个显著作用是行为抑制。然而,对乙醇抑制作用的行为敏感性不足。为了解决这个问题,我们开发了Flypub测定,允许测量在果蝇黑色素气剂中反复接触乙醇后,抑制性求爱活动增加的情况。在这里,我们报告分步 Flypub 检测,包括乙醇暴露室的组装、检测站的设置、苍蝇护理和收集标准、乙醇输送、抑制的求爱活动的量化、数据处理和统计分析。还提供了如何排除关键步骤、克服限制和扩大其效用以评估其他乙醇引起的行为。Flypub测定与果蝇黑色素气仪中强大的遗传工具相结合,将有助于发现乙醇诱导行为敏感性背后的机制。
酒精是世界上最容易获得和广泛消费的药物之一。它具有很高的滥用和成瘾潜力;然而,这一进程背后的机制仍然不完全理解。乙醇诱导抑制、兴奋、认知障碍、多动、失去运动控制和镇水,在蠕虫1,果蝇1,1,2,3,,3小鼠4,大鼠5和人类6,表明常见的神经生物学成分调解乙醇的影响,从无脊椎动物到哺乳动物,包括人类。慢性乙醇摄入导致神经适应和行为改变,这是澳元的基础。其中一个适应是行为敏感性定义为增强反应与乙醇77,8,98,9或其他成瘾物质的重复经验10,11,12。10,11,12
几十年来,关于乙醇诱导行为敏感(EIBS)的研究一直侧重于运动刺激效应,它被用作,7、8、9、138的兴奋反应的代理。79,13例如,大鼠或小鼠重复(每24,48或72小时)乙醇管理显示增强的locomotor活动,测量步行速度88,14,15,16,17,18,19,20,21。,14,15,16,17,18,19,20,21同样,在第一次接触后4小时接触乙醇蒸气的果蝇,也表现出通过步行速度和22次测量的增强的locomotor反应。虽然没有关于EIBS对果蝇的瓣动刺激作用的基本机制的信息,但大鼠和小鼠的研究发现了分子和信号成分(例如多巴胺、谷氨酸和GABA系统)以及神经基质和回路(例如,腹腔皮质区、核结积、杏仁核和前额叶皮层),它们对9,EIB6,起起主要作用。
抑制是乙醇的主要影响,并导致行为的表现,通常受到限制。抑制作用对运动、情感、社会、性及认知功能施加影响,可能导致人类及动物24、25、26、27、28、29型的不当性行为、言语24,25,26,27,28,29或身体攻击及冲动行为。在动物模型中,对机械学研究进行了乙醇引起的抑制研究,其中包括啮齿动物和猴子的机动冲动和攻击性,以及在蠕虫66、9、24、28、29、30中觅食抑制。,9,24,28,29,30我们已经证明,果蝇在乙醇31的影响下表现出抑制性行为。具体来说,野生型雄性苍蝇很少向没有乙醇31的其他雄性求情,而当他们这样做时,求向者会积极拒绝讨好雄性。然而,在乙醇的影响下,雄性苍蝇对其他雄性表现出更多的求爱,而讨好者表现出的拒绝较少,导致男性间求爱的整体增强。值得注意的是,苍蝇对反复接触乙醇时抑制作用形成行为敏感性,这是研究EIBS31,32,32的独特系统。
在本报告中,我们描述了如何设置,执行,故障排除和分析Flypub测定和数据,以研究乙醇引起的抑制和感化在果蝇果蝇果蝇黑色素气。为了提供它的效用和有效性,我们测试了野生型的Canton-S(CS;控制苍蝇应变),以及缺乏酪胺®羟基酶(t_h)的苍蝇,合成八溴胺(OA)。CSOA是无脊椎动物中的主要神经调节剂,33、34,,34在22号苍蝇中乙醇耐受性的发展中起着关键作用。我们首次在这里报告,OA对EIBS很重要。
在本报告中,我们描述了 Flypub 测定的设置和详细协议;一种新方法,用于测量复发性乙醇暴露如何触发抑制求爱和行为敏感。尽管 Flypub 测定相对简单,但几个步骤需要谨慎和注意,以确保可靠的结果。首先,用于测试的苍蝇必须完全色素(即完全发育的成年苍蝇),健康且完好无损。畸形或损伤,特别是他们的翅膀或腿部会影响男性的法庭能力。其次,飞行年龄很重要,必须在对照组和实验组之间匹配(最佳年龄:乙醇接触1时3-5天)。两周和较老的野生型雄性苍蝇往往表现出抑制不拘一格的求爱水平31。因此,适当的年龄匹配的苍蝇在研究是必不可少的,以避免可变的结果。第三,每个酒吧的飞行数量至关重要(最佳:每家酒吧33只)。每个酒吧的飞度较低或更高,会大大扭曲求爱分数(未显示数据)。第四,Flypub 室需要具有相同的卷,如图2B所示。这可确保苍蝇同步接收乙醇蒸气,并且诱导的行为是一致的。第五,清晰的视频录制和精确的求爱评分至关重要。此协议很大程度上依赖于行为观察,因此严格遵守标准化求爱评分协议对于最大限度地减少不一致的结果至关重要。最后,强烈建议盲目地执行乙醇暴露和求爱评分步骤,因为实验者不知道苍蝇基因型或实验治疗,从而防止实验偏差。
Flypub 测定具有多种优势。首先,可以同时测试和比较多组苍蝇。其次,它价格低廉,设置简单,易于学习,因此对包括小学到高中、本科生和研究生、博士后和教职员工以及空间与预算有限的教学实验室在内的各级实验者都十分满意。第三,它可以用来测量其他行为,如雌性苍蝇的抑制求爱和乙醇或其他镇静剂的镇静作用,以评估初始敏感性和耐受性发展和维护31,32。31,Flypub 是一种多功能的方法,用于研究 AUD 的不同功能。
Flypub测定的主要限制是严格和费力的求爱评分方案。乙醇影响的求爱行为非常活跃,求爱时间从不到一秒到几分钟不等,而参与求爱的苍蝇也经常发生变化。此处介绍的评分制度是为了结合这种动态性质,并为给定基因型31、32,32提供单个乙醇暴露的一致分数。如协议所述,求爱活动是手动评分的,这非常耗时。已开发多个自动评分程序,以方便无偏见的高通量行为筛查,所有程序都依赖于个体苍蝇的运动和地点39,40,41,42,43,44,45。39,40,41,42,43,44,45我们还试图开发一种计算机软件,以自动计算求爱活动,但无法获得一致和可靠的结果。这可能是由于行为评分包括多个求爱步骤(即,以下,单边翼延长,腹部弯曲和安装)35,36,46多个35,36,46苍蝇一次。即使有这种限制,具有适当训练的实验者也应该能够准确量化乙醇引起的求爱行为。尽管如此,采用机器学习或其他高级算法作为后续操作将有很大的帮助和重要性。
与啮齿动物模型类似,对苍蝇模型中乙醇的研究主要集中在乙醇的瓣电机刺激和镇静作用上。然而,Flypub的测定,措施抑制求爱,一种认知抑制,这是新颖的31,32。,32因此,Flypub 可以帮助阐明分子参与者、细胞通路和神经回路,以及对行为抑制和敏感至关重要的风险因素(例如年龄、睡眠、饮食或社会环境)。我们先前已经证明,EIBS需要多巴胺信号,这与啮齿动物模型和人类受试者66、9、319,31的发现一致。作为概念的证明,我们检查了缺乏OA的tβh突变体(去甲肾上腺素的无脊椎动物对应物),发现OA对乙醇抑制作用的行为敏感也很重要,尽管其贡献比多巴胺31的贡献相对较小。这一发现与Scholz47的观察相反,即t+h突变苍蝇对乙醇的瓣电机激活效应47的敏感性没有明显损伤。h这表明独特的分子、细胞和神经通路,以促进行为敏感性,抑制与运动激活。后续研究应该进一步配合这一诱人的概念。
总之,Flypub 是一种低成本、多层面和有效的方法来调查对乙醇的行为反应,特别是抑制和行为敏感性,这有助于增进我们对澳元的理解,并提供对这种慢性疾病有效干预的洞察。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NIAAA 1R15A020996、NIMH R21MH109953、脑与行为研究基金会NARSAD和NIMHD 2G12MD007592 NMD集群赠款的支持。我们还感谢 NIH 资助的 RISE 计划 (NIGMS 5R25GM069621) 支持 NMD 和 CMS、支持 NMD 的 UTEP COURI-SURPASS 计划、NIH 资助的 MARC 计划 (NIGMS 2T34GM08048-31) 支持 AA,以及基隆洪博士研究生奖学金支持 EBS。我们非常感谢UTEP传播部门:达琳·巴拉哈斯、克里斯蒂安·里维拉、卡琳娜·莫尔诺、何塞·洛亚·费尔南德斯和音乐部:斯蒂芬·哈达德在视频和画外音制作方面的帮助。最后,我们非常感谢Andreas Thum博士与控制广-S苍蝇一起分享广州-S背景中的t+h突变体;h杰西卡·伯西亚加为她对八溴胺的初步研究做出的宝贵贡献,以及汉实验室成员的讨论和支持。
95 % Ethanol | VWR Chemicals | BDH1158-4LP | |
Canton-S | – | – | wild-type strain used as a control |
Copy stand with arms | Kaiser | 205411 | model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station |
Cotton rounds | Swisspers | COT-027 | to deliver ethanol |
Excel | Microsoft | – | to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used |
Fluorescent light bulb | Lights of America | 7108N | maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station |
Microsoft LifeCam software | Microsoft | – | version 3.60; to videotape flypubs |
Microsoft LifeCam Studio | Microsoft | Q2F-00013 | 1080P HD sensor; to videotape flypubs |
Minitab 17 | Minitab | – | version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used |
Nylon mesh sheet | Sefar Nitex | – | model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub |
Petri dishes | Falcon | 08-757-100A | 35 x 10 mm; to deliever ethanol |
Plastic funnel – mid size | Fisher scientific | 10-348A | 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial |
Plastic funnel – small | Fisher scientific | 07-202-121 | 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub |
Polycarbonate sheet | Lexan | – | 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub |
Round-bottom bottle | Fisher scientific | AS115 | polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub |
Soldering iron | Weller | WES51 | to make a hole in a flypub |
Time code | – | – | .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used |
Tyramine b hydroxylase (tbh) | – | – | mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tbh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany) |
VLC media player | VideoLAN | – | version 3.0.8; any media player can be used to score courtship |