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Environment

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/61067
, ,
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas,Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology,Texas A&M University

Summary

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für das auf Kartoffelvirus X (PVX) basierende microRNA-Silencing-System (VbMS) zur funktionellen Charakterisierung endogener microRNAs (miRNAs) in Kartoffeln. Target Mimic (TM) Moleküle von miRNA von Interesse werden in den PVX-Vektor integriert und vorübergehend in Kartoffeln exprimiert, um die Ziel-miRNA oder miRNA-Familie zum Schweigen zu bringen.

Abstract

Virus-basiertes microRNA-Silencing (VbMS) ist ein schnelles und effizientes Werkzeug zur funktionellen Charakterisierung von microRNAs (miRNAs) in Pflanzen. Das VbMS-System wurde für verschiedene Pflanzenarten entwickelt und angewendet, darunter Nicotiana benthamiana, Tomaten, Arabidopsis, Baumwolle und Monokotyledonen wie Weizen und Mais. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das PVX-basierte VbMS-Vektoren verwendet, um endogene miRNAs in Kartoffeln zum Schweigen zu bringen. Um die Expression einer spezifischen miRNA zu unterdrücken, werden Target-Mimic-Moleküle (TM) von miRNA von Interesse entworfen, in pflanzliche Virusvektoren integriert und in Kartoffeln durch Agrobacterium-Infiltration exprimiert, um direkt an die endogene miRNA von Interesse zu binden und ihre Funktion zu blockieren.

Introduction

Pflanzliche microRNAs (miRNAs) werden als 20–24 nukleotidlange, kernkodierte regulatorische RNAs1 charakterisiert und spielen eine grundlegende Rolle in fast jedem Aspekt pflanzenbiologischer Prozesse, einschließlich Wachstum und Entwicklung2,3, Photosynthese und Metabolismus4,5,6,7, Hormonsynthese und Signalisierung8,9, biotische und abiotische Reaktionen10, 11,12,13 und Nährstoff- und Energieregulierung14,15. Die regulatorischen Rollen von pflanzlichen miRNAs sind gut programmiert und werden typischerweise auf posttranskriptionaler Ebene erfüllt, indem die Ziel-mRNAs entweder gespalten oder translational unterdrückt werden.

Enorme Fortschritte wurden bei der Identifizierung, transkriptionellen Profilerstellung und Zielvorhersage von miRNAs in Kartoffeln gemacht16,17,18,19,20,21. Die funktionelle Charakterisierung von miRNAs in Pflanzen, einschließlich Kartoffeln, ist jedoch aufgrund des Mangels an effizienten und hochdurchsatzigen genetischen Ansätzen hinter anderen Organismen zurückgeblieben. Es ist eine Herausforderung, eine funktionelle Analyse einzelner miRNA durch Standard-Loss-of-Function-Analyse durchzuführen, da die meisten miRNAs zu Familien mit erheblicher genetischer Redundanz gehören22. Darüber hinaus kann eine einzelne miRNA mehrere Zielgene kontrollieren23 und mehrere verschiedene miRNAs können denselben molekularen Signalweg gemeinsam modulieren24,25. Diese Eigenschaften machen es schwierig, die Funktion einer bestimmten miRNA oder einer miRNA-Familie zu charakterisieren.

Ein Großteil der funktionalen Analyse von miRNAs stützt sich stark auf Ansatzmöglichkeiten mit Funktionsverstärkung, die offensichtliche Einschränkungen aufweisen. Die künstliche miRNA (amiRNA)-Methode nutzt die endogenen primären Transkripte (pri-miRNAs), um miRNAs auf hohem Niveau zu produzieren, was zu einer Hemmung der Zielgenexpression führt26,27,28,29. Aktivierungsmarkierung und miRNA-Überexpression unter Verwendung eines starken konstitutiven 35S-Promotors führen jedoch häufig zu einer erhöhten Expression von miRNAs, die nicht repräsentativ für In-vivo-Bedingungen sind und daher möglicherweise nicht die endogene Funktion von miRNAs widerspiegeln30. Es wurde ein alternativer Ansatz entwickelt, der die Expression von miRNA-resistenten Formen von Zielgenen beinhaltet, die unreibbare Mutationen in den Bindungs- und/oder Spaltungsstellen enthalten31,32,33. Dieser Ansatz kann jedoch auch zu einer Fehlinterpretation des Phänotyps führen, der vom miRNA-resistenten Zieltransgen aufgrund transgener Artefakte abgeleitet wurde. Daher sollten Schlussfolgerungen aus diesen Untersuchungen zum Funktionsgewinn mit Vorsicht gezogen werden34. Eine weitere große Einschränkung der oben beschriebenen Ansätze besteht darin, dass sie eine Transformation erfordern, die arbeitsintensiv und zeitaufwendig ist. Darüber hinaus sind die transgenabhängigen Ansätze für transform-widerspenstige Pflanzenarten kaum anwendbar. Daher ist es wichtig, einen schnellen und effizienten Loss-of-Function-Ansatz zu entwickeln, um die Funktion von miRNAs zu entschlüsseln.

Um die Voraussetzung des Transformationsverfahrens zu umgehen, wurde ein virusbasiertes microRNA-Silencing (VbMS) etabliert, indem die Target-Mimic-Strategien (TM) mit virus-abgeleiteten Vektoren kombiniert werden. Im VbMS-System werden künstlich konstruierte TM-Moleküle vorübergehend von einem Virus-Backbone exprimiert und bieten ein leistungsfähiges, hochdurchsatzreiches und zeitsparendes Werkzeug, um die Funktion von pflanzlichen endogenen miRNAs zu sezieren35,36. VbMS wurde ursprünglich in N. benthamiana und Tomaten mit dem Tabakrasselvirus (TRV)35,36,37 entwickelt und unter Verwendung verschiedener anderer Virusexpressionssysteme auf Arabidopsis, Baumwolle, Weizen und Mais ausgedehnt, darunter Kartoffelvirus X (PVX)38, Baumwollblattknautschvirus (ClCrV)39, Gurkenmosaikvirus (CMV)40,41,42, Chinesisches Weizenmosaikvirus (CWMV)43 , und Gerstenstreifenmosaikvirus (BSMV)44,45.

Die Kartoffel (Solanum tuberosum) ist die viertwichtigste Nahrungspflanze und die am weitesten verbreitete Noncerealpflanze der Welt, vor allem wegen ihres hohen Nährwerts, ihrer hohen Energieproduktion und ihres relativ geringen Inputbedarfs46. Mehrere Eigenschaften der Kartoffel machen sie zu einer attraktiven zweikeimblättrigen Modellpflanze. Es ist eine vegetativ vermehrte polyploide Pflanze mit hoher Auskreuzungsrate, Heterozygotie und genetischer Vielfalt. Bis heute gibt es jedoch keinen Bericht, der die Funktion von miRNAs in Kartoffeln mit VbMS charakterisiert. Hier stellen wir einen ligationsunabhängigen Klonierungs-(LIC)-angepassten Kartoffel-PVX-basierten VbMS-Ansatz vor, um die Funktion von miRNAs in Kartoffelpflanzen zu bewerten38. Wir haben die miR165/166-Familie ausgewählt, um den VbMS-Assay zu veranschaulichen, da die miR165/166-Familie und ihre Ziel-mRNAs und Transkriptionsfaktoren der Klasse III Homöodomänen/Leu-Reißverschluss (HD-ZIP III) umfassend charakterisiert wurden22,47,48. Die HD-ZIP III-Gene sind Schlüsselregulatoren der Meristementwicklung und Organpolarität, und die Unterdrückung der miR165/166-Funktion führt zu einer erhöhten Expression der HD-ZIP III-Gene, was zu pleotropen Entwicklungsdefekten wie reduzierter apikaler Dominanz und abweichenden Mustern der Blattpolarität führt22,35,38,41 . Die leicht scorablen Entwicklungsphänotypen, die mit dem Silencing von miRNA165/166 korrelieren, ermöglichen eine genaue Bewertung der Wirksamkeit des PVX-basierten VbMS-Assays.

In dieser Studie zeigen wir, dass das PVX-basierte VbMS-System die Funktion von miRNAs in Kartoffeln effektiv blockieren kann. Da das PVX-basierte virusinduzierte Gen-Silencing-System (VIGS) in einer Reihe von Kartoffelsorten etabliert wurde49,50,51,52, kann dieser PVX-basierte VbMS-Ansatz wahrscheinlich auf eine breite Palette von diploiden und tetraploiden Kartoffelarten angewendet werden.

Protocol

1. Wachsen Sie Kartoffelpflanzen. Vermehrung von In-vitro-Kartoffelpflanzen in Kulturröhrchen (25 x 150 mm) mit Murashige und Skoog (MS) Medien plus Gamborg-Vitamin (MS-Basalsalzmischung, Gamborg-Vitamin, 30 g/L Saccharose, 3,5 g/L Agar, pH = 5,7). Platzieren Sie die Röhren im Wachstumsraum unter 20–22 °C, 16 h Licht/8 h dunkler Photoperiode und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙s1.HINWEIS: Neue Triebe und Wurzeln entwickeln sich normalerweise in 1-2 Wochen aus Pflanzen. V…

Representative Results

Abbildung 2 zeigt die PVX-STTM165/166 Kartoffelpflanzen (Katahdin) mit ektopischem Wachstum von Blattgeweben von der Abaxialseite der Blattlamina entlang der Venen. Schwerere Phänotypen wie trompetenförmige Blattbildung wurden ebenfalls beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde in den PVX-Kontrollanlagen keine phänotypische Anomalie beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das VbMS-System die endogene miRNA-Funktion in tetraploiden Kartoffelpflanzen wirksam unterdrückte und das PVX-VbMS-Syste…

Discussion

Wir präsentieren ein PVX-basiertes miRNA-Silencing-System zur Charakterisierung der Funktion von endogenen miRNAs in Kartoffeln durch Integration des STTM-Designs in den PVX-Vektor. Das VbMS-System erwies sich als wirksam bei der Stummschaltung von miRNA165/166 in Kartoffeln, einer hochkonservierten miRNA-Familie über Pflanzenarten hinweg.

Der TM-Ansatz wurde entwickelt, um die Expression von miRNAs auf der Grundlage einer künstlichen miRNA-Zielmimik zu stören, die eine Mismatch-Schleife a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Yule Liu von der Tsinghua University für die Bereitstellung des PVX-LIC-Vektors. Diese Arbeit wurde von einem Start-up-Fonds der Texas A&M AgriLife Research und dem Hatch Project TEX0-1-9675 des USDA National Institute of Food and Agriculture an JS unterstützt.

Materials

100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter – 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).
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