Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Summary

Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

Abstract

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune do sistema nervoso central (SNC) causada pela combinação de fatores ambientais e histórico genético suscetível. Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo típico de doença de MS amplamente utilizado para investigar a patogênese na qual linfócitos T específicos para antígenos de mielina iniciam uma reação inflamatória no SNC. É muito importante avaliar como os linfócitos do SNC regulam o desenvolvimento da doença. No entanto, a abordagem para medir a quantidade e a qualidade dos linfócitos infiltrados no SNC é muito limitada devido às dificuldades em isolar e detectar linfócitos infiltrados do cérebro. Este manuscrito apresenta um protocolo para que seja útil para o isolamento, identificação e caracterização de linfócitos infiltrados do CNS e será útil para nossa compreensão de como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune CNS.

Introduction

Como doença desmielinizante crônica do SNC, a ESM afeta cerca de 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo e carece de tratamentos curativos¹. Também é considerada uma doença autoimune, na qual linfócitos T específicos de mielina iniciam uma reação inflamatória e levam à desmielinização e lesão axila no CNS². A encefalomielite autoimune experimental (EAE) tem sido amplamente utilizada para investigar mecanismos patogênicos da ESM como um modelo clássico de doença desmielinização autoimune no CNS³. Existem duas maneiras de induzir o EAE: uma é induzir o EAE ativamente imunizando animais com componentes de mielina, outra é a transferência adotiva transferindo células T encefalitárias para o receptor^2,,4,,5. As suscetibilidades à EAE são diferentes em diferentes cepas animais⁶. Em camundongos C57BL/6, o desafio de mielina oligodendrocyte glicoproteína (MOG) 35-55 induz uma doença monofásica com desmielinização extensiva e inflamação no CNS, que é frequentemente usado em experimentos com camundongos direcionados a genes⁷.

A geração de células T reativas específicas da mielina é necessária para a ocorrência e desenvolvimento da doença na EAE e é um sinal imunológico tanto da EAE quanto da EAE. Linfócitos T autoretivos ativados cruzam a barreira cerebral sanguínea (BBB) para a doença saudável do CNS e iniciam a doença da EAE. Quando o MOG 35-55 Ag é encontrado, esses linfócitos T induzem inflamação e o recrutamento de células effectoras para o CNS, resultando em desmielinização e destruição de axônio^8,,9. No modelo EAE, há amplas evidências de que as células CD4⁺ T específicas do neuroantígeno podem iniciar e sustentar neuroinflamação e patologia^3,,10. Dependendo das principais citocinas produzidas, os linfócitos CD4⁺ T foram classificados em diferentes subconjuntos: Th1 (caracterizado pela produção de interferon-γ), Th2 (caracterizado pela produção de interleucina 4) e Th17 (caracterizado pela produção de interleucina 17). Acredita-se que a ativação das células Th1 e Th17 contribuam para a indução, manutenção e regulação da desmielinização inflamatória na EAE e MS, secretando os efeitos IFN-γ e IL-17, capazes de ativar macrófagos e recrutar neutrófilos para os locais inflamatórios para acelerar as lesões¹¹.

Como as células T autoativas cruzam o BBB para o CNS e induzem o desenvolvimento da doença em MS e EAE, é muito importante analisar as células T no SNC. No entanto, há muito poucos protocolos estabelecidos para o isolamento de linfócitos do CNS¹². Por isso, foi desenvolvido um método otimizado para isolar células mononucleares do cérebro e analisar linfócitos T com marcadores CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 para citometria de fluxo. O método utiliza o MOG35-55 adjuvante Mycobacterium tuberculosis H37 Ra and Pertussis Toxin Working Solution (PTX) para induzir um modelo ativo de imunização de EAE em camundongos. Em seguida, métodos de centrifugação de gradiente de separação mecânica e densidade são usados para o isolamento de células mononucleares CNS. Finalmente, uma estratégia otimizada de citometria de fluxo é usada para identificar linfócitos T e subconjuntos do cérebro, manchando vários marcadores.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo comitê animal da Escola de Ciências Médicas Básicas da Universidade de Xangai Jiao Tong. 1. Preparação dos materiais Use a sequência MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK de MOG35-55 para obter o peptídeo liofilizado de fontes comerciais. Certifique-se de que a pureza do peptídeo é >95%. Prepare a solução de estoque MOG de 10 mg/mL em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e armazene a -20 °C. Prepare uma solução d…

Representative Results

Após a imunização de camundongos C57BL/6, todos os camundongos foram pesados, examinados e classificados diariamente para sinais neurológicos. O curso clínico representativo da EAE deve resultar em uma curva da doença como apresentado na Figura 2A e uma mudança de peso corporal no camundongo como apresentado na Figura 2B. Os camundongos C57BL/6 imunizados com MOG35-55 geralmente começaram a desenvolver sintomas da doença por volta do dia 10-12 e atingir…

Discussion

Este estudo apresenta um protocolo para induzir e monitorar a EAE usando MOG35-55 em camundongos C57BL/6, que são considerados um modelo animal experimental neuroimunológico típico de MS. EAE pode ser induzido variando as cepas de camundongos ou o tipo de proteína usada para indução de acordo com a finalidade do estudo. Por exemplo, o uso de peptídeos PLP139-151 em camundongos SJL pode induzir um curso de doença EAE que é especialmente adequado para avaliar efeitos terapêuticos em recaídas^15<…

Materials

Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2	eBioscience	56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block	BioLegend	101302
APC anti-mouse IFN-g	eBioscience	17-7311-82
BD LSRFortessa X-20	BD
Dounce homogenizer	Wheaton	353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)	eBioscience	00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set	eBioscience	88-8824-00
FITC anti-mouse CD3	BioLegend	100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)	Sigma-Aldrich	F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience	eBioscience	56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra	Difco Laboratories	231141
PE anti-mouse IL-17A	eBioscience	12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4	BioLegend	100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400617
Percoll	GE	17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b	BioLegend	101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400631
pertussis toxin (PTX)	Sigma-Aldrich	P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience	eBioscience	17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience	eBioscience	12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides	Biosynth International		MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK