Ici, des protocoles standardisés sont présentés pour évaluer l’induction de la réponse de choc thermique (HSR) à Caenorhabditis elegans en utilisant RT-qPCR au niveau moléculaire, les journalistes fluorescents au niveau cellulaire, et la thermorecovery au niveau de l’organisme.
La réponse de choc thermique (HSR) est une réponse de stress cellulaire induite par la mauvaise pliage de protéines cytosoliques qui fonctionne pour restaurer l’homéostasie de pliage des protéines, ou protéostasie. Caenorhabditis elegans occupe une niche unique et puissante pour la recherche HSR parce que le HSR peut être évalué aux niveaux moléculaire, cellulaire et organisme. Par conséquent, les changements au niveau moléculaire peuvent être visualisés au niveau cellulaire et leurs impacts sur la physiologie peuvent être quantités au niveau de l’organisme. Bien que les essais de mesure du RSH soient simples, les variations dans le moment, la température et la méthodologie décrites dans la littérature rendent difficile la comparaison des résultats entre les études. De plus, ces questions constitueraient un obstacle pour quiconque cherche à intégrer l’analyse du RSS dans ses recherches. Ici, une série de protocoles est présenté pour mesurer l’induction du HSR d’une manière robuste et reproductible avec RT-qPCR, les journalistes fluorescents, et un essai thermorecovery organisme. En outre, nous montrons qu’un test de thermotélérance largement utilisé ne dépend pas du régulateur principal bien établi du HSR, HSF-1, et ne devrait donc pas être utilisé pour la recherche HSR. Enfin, les variations de ces essais trouvés dans la littérature sont discutées et les meilleures pratiques sont proposées pour aider à normaliser les résultats dans tout le domaine, en fin de compte faciliter la maladie neurodégénérative, le vieillissement, et la recherche HSR.
La réponse de choc thermique (HSR) est une réponse universelle de stress cellulaire induite par l’erreur de protéine cytosolique causée par des augmentations de température et d’autres contraintes protéotoxiques. L’activation du HSR à Caenorhabditis elegans conduit à l’upregulation transcriptionnelle des gènes de choc thermique tels que hsp-70 et hsp-16.2. De nombreuses protéines de choc thermique (HSP) fonctionnent comme des chaperons moléculaires qui restaurent l’homéostasie pliable des protéines, ou protéostasie, en interagissant directement avec des protéines mal repliées ou endommagées. Le régulateur principal du HSR est le facteur de transcription Heat Shock Factor 1 (HSF-1), dont l’activation est élégamment contrôlée via plusieurs mécanismes1.
Le rôle de HSF-1 ne se limite pas au stress. HSF-1 est nécessaire pour une croissance et un développement normaux, car la suppression de hsf-1 conduit à l’arrestation larvaire2. HSF-1 est également important pendant le vieillissement et les maladies neurodégénératives liées à l’âge caractérisées par l’accumulation d’agrégats de protéines et une incapacité à maintenir la protéostase. Knockdown de hsf-1 provoque l’accumulation d’agrégats de protéines et une durée de vie raccourcie, tandis que la surexpression de hsf-1 réduit l’agrégation des protéines et prolonge la durée de vie3,4. Par conséquent, la régulation du HSF-1 au niveau moléculaire a de vastes implications pour la physiologie et la maladie de l’organisme.
C. elegans est un organisme modèle puissant pour la recherche HSR parce que le HSR peut être mesuré aux niveaux moléculaire, cellulaire et organisme4,5,6. Soulignant la puissance de ce modèle, des progrès clés dans la délimitation de la voie HSR, telles que les différences spécifiques aux tissus dans la régulation du RSH, ont été découverts dans C. elegans7,8. En outre, C. elegans est largement utilisé pour la recherche sur le vieillissement et est un système émergent pour la modélisation des maladies liées à la perturbation de la protéostase.
Bien que les expériences de choc thermique avec C. elegans puissent être rapides et reproductibles, il y a plusieurs questions à considérer avant de commencer. Par exemple, quelle température doit être utilisée pour l’induction du RSH et combien de temps les vers doivent-ils être exposés? Est-il préférable d’utiliser un incubateur sec ou un bain d’eau? Quel stade de développement doit être utilisé? Malheureusement, les méthodes utilisées pour étudier le RSH varient considérablement d’un laboratoire à l’autre, ce qui cause de la confusion lors de la sélection des meilleures méthodologies et rend difficile la comparaison des résultats sur le terrain.
Nous présentons des protocoles robustes et normalisés pour l’utilisation de RT-qPCR, de reporters fluorescents et de thermorecovery pour mesurer le HSR. Bien que ces trois approches soient complémentaires, elles présentent chacune des avantages et des inconvénients uniques. Par exemple, rt-qPCR est la mesure la plus directe et quantitative du RSH, et ce test peut être facilement étendu pour inclure de nombreux gènes différents de choc thermique inductible. Cependant, RT-qPCR est le plus cher, peut être techniquement difficile, et nécessite l’utilisation d’équipement spécialisé. En revanche, les journalistes fluorescents ont l’avantage de mesurer les différences spécifiques aux tissus dans l’induction du HSR. Cependant, ils sont difficiles à quantifier avec précision, ne peuvent mesurer l’induction au-dessus d’un certain seuil, et nécessitent l’utilisation d’un microscope à fluorescence. En outre, les souches de journaliste décrites ici sont en retard de développement par rapport à la souche standard N2. Bien que de nouvelles souches de reporter contenant des transgènes à copie unique soient disponibles, elles n’ont pas été testées ici9. Le troisième test, la thermorecovery, a l’avantage de fournir une lecture physiologiquement pertinente au niveau de l’organisme. Cependant, ce test est sans doute le moins sensible et le plus indirect. Enfin, nous discutons de quelques variations communes trouvées dans ces essais et proposons un ensemble de pratiques exemplaires pour faciliter la recherche dans ce domaine.
Dans la littérature, une grande variété de températures, de temps et d’équipement ont été utilisés pour évaluer le RSH, qui a introduit des mises en garde inutiles et a eu des difficultés à comparer les résultats entre les laboratoires. Par exemple, des températures allant de 32 à 37 °C et des temps de 15 min à plusieurs heures ont été utilisées pour induire le HSR15. Cependant, il est signalé que la létalité se produit dès 3 h à 37 °C pour toutes les étapes et 1,5 h pour le jour 1 adultes15. En outre, nous montrons que l’exposition des vers à 35 °C provoque une létalité qui n’est pas dépendante du HSF-1, ce qui rend ces conditions mal adaptées à l’analyse du RSH. En revanche, un choc thermique de 33 °C pour 1 h est suffisamment robuste pour provoquer une forte induction des gènes de choc thermique, mais assez doux pour ne pas affecter la viabilité des vers. En effet, l’exposition à 33 °C aussi longtemps que 6 h ne provoque que 20% des vers à afficher un mouvement anormal. Par conséquent, nous proposons d’utiliser une température de 33 °C et un temps de 1 h comme condition normalisée pour les tests RT-qPCR et fluorescents.
Des expériences récentes ont révélé que la mise en scène développementale des vers pour les expériences HSR est particulièrement importante. Il a été récemment démontré que dans C. elegans l’inducibilité du RSH diminue (c.-à-d. s’effondre) de >50% lorsque les hermaphrodites commencent la ponte5. La mise en scène correcte des vers est essentielle parce qu’il y a souvent des différences dans le moment du développement dans les souches porteuses de mutations. Si des mutants sensibles à la température sont utilisés, cela aura également un impact sur les résultats s’ils ne sont pas synchronisés par leur âge de reproduction. Par conséquent, il est recommandé de mesurer soigneusement l’apparition de la ponte pour chaque souche afin de déterminer quand l’effondrement se produit. La fenêtre du temps après la mue L4 et avant l’initiation de la maturité reproductrice est étroite; par conséquent, il faut veiller à ce que l’effondrement du RSH ne provoque pas par inadvertance de variabilité des résultats.
En plus du moment de développement, des changements de température étonnamment faibles, aussi peu que 1 °C, peuvent avoir des effets substantiels sur le RSH. Par exemple, les neurones thermosensoriels de C. elegans sont sensibles aux changements de température aussi petits que ±0,05 °C16. Ainsi, il est impératif d’utiliser un thermomètre qui peut mesurer avec précision la température. Par conséquent, nous proposons, comme meilleures pratiques, l’utilisation d’un dispositif calibré pour la mesure de la température suffisamment précis pour mesurer les températures à ±0,1 °C. En outre, un thermomètre doté d’une fonctionnalité de journalisation des données doit être utilisé pour mesurer les variations de température dans le temps. De nombreux incubateurs sont spécifiés pour avoir des variations thermiques de plus de 1 °C dans différentes parties de l’incubateur et à travers le temps, ce qui peut avoir des effets significatifs sur les expériences HSR. Comme une pratique exemplaire, nous suggérons d’utiliser des incubateurs qui ont suffisamment d’isolation et de circulation pour minimiser les fluctuations de température. Pour mener des expériences de choc thermique, nous proposons une meilleure pratique d’un bain d’eau circulant. Le temps qu’il faut pour une plaque d’agar pour atteindre une température désirée est d’environ 6-7 min dans un bain d’eau, mais beaucoup plus longtemps dans un incubateur sec15,17. Toutefois, si un bain d’eau circulant n’est pas disponible, nous avons montré que l’induction robuste de HSR se produit également dans un incubateur sec utilisant nos conditions. Si un incubateur sec est utilisé, l’ouverture de l’incubateur pour la durée du stress doit être réduite au minimum.
Il est bien établi que l’induction des gènes de choc thermique dépend du régulateur principal du HSR, HSF-1. Ici, nous présentons des preuves que les deux tests plus indirects, les journalistes fluorescents et la thermorecovery, dépendent également de HSF-1. De manière significative, nous avons constaté qu’un test organisme de remplacement couramment utilisé, la thermotolérance, n’est pas dépendant de HSF-1 en utilisant hsf-1 RNAi (Figure 4). Des résultats similaires ont été précédemment rapportés à l’aide d’un mutant hsf-1 ou d’un mutant ttx-3, qui bloque le HSR18,19,20. Ensemble, ces résultats indiquent que le test de thermotélérance ne devrait pas être utilisé pour la recherche sur le RSH. En outre, cela suggère qu’une meilleure pratique consiste à tester la dépendance hsf-1 pour tout test utilisé pour mesurer le RSH.
Ensemble, nous présentons une série de protocoles normalisés et de pratiques exemplaires pour une mesure robuste et reproductible de l’induction du HSR dans C. elegans. Nous espérons que ces méthodologies diminueront la variabilité des expériences de RSH et augmenteront la reproductibilité. Faciliter les comparaisons directes de la recherche sur le RSH entre les laboratoires permettra d’accélérer la recherche dans le domaine du RSH. En outre, la normalisation bénéficiera à la recherche sur le vieillissement et les maladies neurodégénératives avec lesquelles le RSH est intimement associé.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par un don de Frank Leslie. Certaines souches ont été fournies par la CCG, qui est financée par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440).
18S-forward primer | TTGCGTCAACTGTGGTCGTG | ||
18S-reverse primer | CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG |
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AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] | Morimoto lab | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/ | |
C12C8.1-forward primer | GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT |
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C12C8.1-reverse primer | ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC | ||
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855200 | |
CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD | Lascar | EL-USB-TP-LCD | |
Greenough Stereo Microscope S9i Series | Leica | ||
Hard Shell 96 Well PCR Plates | Bio Rad | HSS9601 | |
hsp-16.2-forward primer | ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC |
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hsp-16.2-reverse primer | CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG | ||
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio Rad | 1708891 | |
iTaq Universal Sybr Green Super Mix | Bio Rad | 1725121 | |
Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Eclipse 90i | |
MultiGene OptiMax Thermo Cycler | Labnet | TC9610 | |
N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE | |
Parafilm M Roll | Bemis | 5259-04LC | |
RapidOut DNA Removal Kit | Thermo Scientific | K2981 | |
Recirculating Heated Water Bath | Lauda Brinkmann | RE-206 | |
Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer | Fisher Scientific | 15-081-103 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation reagent |
TurboMix Attachment | Scientific Industries | SI-0564 | |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 |