Aislamiento de myofibrils de biopsias de músculo esquelético y determinación de la función contráctil con un transductor de fuerza de resolución Nano-Newton
Summary
Aquí se presenta un protocolo para evaluar las propiedades contráctiles de los miofibriles musculares estriados con resolución nano-Newton. El protocolo emplea una configuración con una sonda de fuerza óptica basada en interferometría. Esta configuración genera datos con una alta relación señal-ruido y permite la evaluación de la cinética contráctil de myofibrils.
Abstract
Las células musculares estriadas son indispensables para la actividad de los seres humanos y los animales. Las fibras musculares individuales se componen de miofibrils, que consisten en sarcomeres ligados en serie, las unidades contráctiles más pequeñas en el músculo. La disfunción sarcomerica contribuye a la debilidad muscular en pacientes con mutaciones en genes que codifican para proteínas sarcoméricas. El estudio de la mecánica de myofibril permite la evaluación de las interacciones actin-miosina sin posibles efectos confusos de myofibriles dañados, adyacentes al medir la contractilidad de fibras musculares individuales. El daño ultraestructural y la desalineación de los myofibrils podrían contribuir a la contractilidad deteriorada. Si hay daños estructurales en los miofibrils, es probable que se rompan durante el procedimiento de aislamiento o durante el experimento. Además, los estudios en miofibrils proporcionan la evaluación de las interacciones actin-miosina en presencia de las limitaciones geométricas de los sarcomeres. Por ejemplo, las mediciones en miofibrils pueden dilucidar si la disfunción miofibrilar es el efecto principal de una mutación en una proteína sarcomérica. Además, la perfusión con soluciones de calcio o compuestos es casi instantánea debido al pequeño diámetro del myofibril. Esto hace que las miofibriles sean eminentemente adecuadas para medir las tasas de activación y relajación durante la producción de fuerza. El protocolo descrito en este artículo emplea una sonda de fuerza óptica basada en el principio de un interferómetro Fabry-Pérot capaz de medir fuerzas en el rango nano-Newton, acoplado a un motor de longitud piezoeléctrica y un sistema de perfusión de paso rápido. Esta configuración permite el estudio de la mecánica myofibril con mediciones de fuerza de alta resolución.
Introduction
Las células musculares estriadas son indispensables para las actividades de la vida diaria. El movimiento de las extremidades, la función respiratoria y el movimiento de bombeo del corazón dependen de la fuerza generada por las células musculares. El músculo esquelético consiste en fascículos musculares que contienen haces de fibras musculares individuales (Figura 1A). Estas fibras musculares se componen de miofibrils, que están formados por sarcomeres conectados en serie (Figura 1B,D). Los sarcomeres contienen filamentos delgados y gruesos. Estos consisten principalmente en cadenas de moléculas de actina y miosina, respectivamente (Figura 1B). Las interacciones actin-miosina son responsables de la capacidad de generación de fuerza del músculo. Los pacientes con mutaciones en genes que codifican proteínas sarcoméricas, como la neblina, la actina y la troponina T, sufren de debilidad muscular debido a la disfunción contráctil1.
La calidad de la contractilidad muscular se puede estudiar en varios niveles de organización, que van desde músculos enteros in vivo a interacciones actina-miosina en ensayos de motilidad in vitro. Durante las últimas décadas, varios grupos de investigación han desarrollado configuraciones para determinar la contractilidad de las miofibrils individuales2,3,4,5,6,7,8,9,10. Estas configuraciones se basan en la detección de cambios en la desviación láser de un voladizo (es decir, desviación de haz óptico) causada por la contracción del myofibril (para más detalles, véase Labuda et al.11). Aunque la determinación de la función contráctil de myofibrils tiene algunas limitaciones (por ejemplo, la dinámica de los procesos de acoplamiento de excitación-contracción que están aguas arriba de los miofibrils son faltantes), hay múltiples ventajas a este enfoque. Estos incluyen: 1) la capacidad de evaluar las interacciones actin-miosina en presencia de las limitaciones geométricas de los sarcomeres; 2) la capacidad de evaluar las interacciones entre la actina y la miosina sin posibles efectos confusos de los miofibriles adyacentes dañados (al medir la contractilidad de las fibras musculares individuales daño ultraestructural y la desalineación de myofibrils podría contribuir a la contractilidad deteriorada) (Figura 1D); 3) el pequeño diámetro de las miofibriles (1 m, Figura 2A)y la falta de membranas permiten la difusión casi instantánea del calcio en los sarcomeres. Además, si hay daños estructurales en los miofibrils, es probable que se rompan durante su aislamiento o durante el experimento. Por lo tanto, evaluar la contractilidad de myofibril es un método elegante para estudiar los mecanismos básicos de la contracción muscular y para entender si las interacciones alteradas actina-miosina son la causa principal de la enfermedad muscular causada por mutaciones en proteínas sarcoméricas.
Este protocolo presenta una nueva configuración para determinar la contractilidad de los myofibrils que incorporan una sonda de fuerza en voladizo con resolución nano-Newton (es decir, Optiforce). Esta sonda de fuerza se basa en el principio de interferometría. La interferometría permite el uso de voladizos relativamente rígidos. Esto hace posible medir la fuerza con poca desviación del voladizo, acercándose a las contracciones isométricas del miofibril. La sonda permite la evaluación de fuerzas pasivas y activas bajas producidas por un solo miofibril aislado de diferentes biopsias musculares, incluidas las de sujetos humanos, con una alta relación señal-ruido. La sonda de fuerza en voladizo óptico incorporada en esta configuración se basa en un interferómetro Fabry-Pérot12. El interferómetro detecta pequeños desplazamientos entre una fibra óptica y un voladizo recubierto de oro montado en una férula (Figura 3). La brecha entre la fibra óptica y el voladizo se llama la cavidad Fabry-Pérot. Las miofibrils se montan entre la sonda y el motor piezoeléctrico utilizando dos fibras de montaje de vidrio recubiertas de pegamento. La fuerza producida por el myofibril puede derivarse matemáticamente de los datos del interferómetro. La interferometría se basa en la superposición o interferencia de dos o más ondas (en esta configuración tres ondas de luz). La luz láser con una longitud de onda entre 1.528.77–1.563.85 nm se emite desde el interferómetro y se envía a través de la fibra óptica. En la sonda, la luz se refleja 1) en la interfaz entre la fibra óptica y el medio (Figura 3A); 2) en la interfaz del medio y el voladizo (Figura 3B); y 3) en la interfaz entre el revestimiento metálico y dorado del voladizo(Figura 3C). La reflexión en la interfaz A y B depende del índice de refracción (n) del medio en el que se sumerge la sonda. La luz, que consta de los tres reflejos superpuestos, vuelve a un fotodiodo en el interferómetro. El fotodiodo mide la intensidad de la luz, que es el resultado del patrón de interferencia de los tres reflejos superpuestos. Cuando la fuerza contráctil se genera activando o estirando un miofibril, el miofibril tira del voladizo. Este movimiento cambia el tamaño de la cavidad (d) y, en consecuencia, el número de longitudes de onda que caben en la cavidad. La luz reflejada en el voladizo tendrá una fase diferente, lo que resulta en un patrón de interferencia diferente. El fotodiodo registra este cambio de la intensidad del patrón de interferencia como un cambio en Voltios. Posteriormente, la generación de la fuerza miofibril se calcula a partir de este cambio, teniendo en cuenta la rigidez en voladizo. La sonda de fuerza es calibrada por el fabricante empujando la punta de la aguja de montaje, unida al extremo de entrega libre del voladizo, contra una báscula de pesaje manteniendo la flexión del voladizo igual a un múltiplo de la longitud de onda del láser de lectura13. Por lo tanto, la interferometría es un método altamente sensible para detectar pequeños cambios en la distancia, lo que permite medir las fuerzas con resolución nano-Newton. Esta resolución permite evaluar la producción de fuerza miofibrilar con una alta relación señal-ruido. Mientras que la interferometría tradicional limita el rango de mediciones a la parte lineal de la curva de interferencia, el uso de un amplificador de bloqueo y la modulación de la longitud de onda láser supera esta limitación14. Esto se explica con más detalle en la sección de discusión.
Para medir la tensión activa de myofibril, se incorporó un sistema de perfusión de paso rápido para exponer el myofibril a soluciones de calcio (Figura 4A). El sistema de perfusión de paso rápido permite que se produzcan cambios en la solución en un plazo de 10 ms. Debido a su pequeño diámetro, la difusión de calcio en los miofibrils es casi instantánea. Por lo tanto, este sistema es particularmente adecuado para medir las tasas de unión actin-miosina durante la activación y liberación durante la relajación. La velocidad de activación (kACT) y la relajación (kREL) se pueden determinar a partir de las curvas de activación-relajación. Además, al exponer los miofibrils a soluciones de calcio de concentración creciente, se puede determinar la relación fuerza-calcio y la sensibilidad al calcio.
Además, un motor de longitud piezoeléctrica permite un rápido estiramiento y acortamiento del myofibril. Esto ofrece la posibilidad de estudiar las propiedades viscoelásticas (es decir, la tensión pasiva) del myofibril, así como realizar un rápido acortamiento y desarme de la miofibril para determinar la tasa de reurbanización de tensión (kTR). Los parámetros recuperados de experimentos de tensión activa y pasiva pueden ser alterados por mutaciones genéticas en una proteína sarcomerica.
Esta configuración personalizada se utilizó para medir las características contráctiles activas y pasivas de los myofibrils aislados del músculo esquelético humano, paciente y ratón sano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrito es un protocolo para evaluar la función contráctil de los miofibrils aislados de los tejidos musculares esqueléticos humanos o animales. La resolución de fuerza de esta configuración ha sido descrita anteriormente por Chavan et al.12. En resumen, está determinada por las fluctuaciones aleatorias de la longitud de la cavidad Fabry-Pérot formada entre la fibra de detección y el voladizo, que producen la parte dominante del ruido a la salida de la lectura (expresada en V) que, multip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por AFM-Telethon y A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. Los autores desean reconocer al creador de los productos mencionados en este artículo, IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
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