Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.
Los cultivos celulares bidimensionales (2D) no imitan satisfactoriamente el crecimiento tumoral in vivo. Por lo tanto, se desarrollaron modelos de esferoides de cultivo tridimensionales (3D). Estos modelos pueden ser particularmente importantes en el campo de la neurooncología. De hecho, los tumores cerebrales tienen la tendencia a invadir el ambiente cerebral sano. Aquí describimos un ensayo ideal basado en esferoides de glioblastoma 3D que desarrollamos para estudiar la invasión tumoral. Proporcionamos todos los detalles técnicos y herramientas analíticas para realizar con éxito este ensayo.
En la mayoría de los estudios que utilizan líneas celulares primarias o disponibles comercialmente, los ensayos se realizan en células cultivadas en superficies plásticas como cultivos monocapa. La gestión del cultivo celular en 2D representa desventajas, ya que no imita un entorno de células 3D in vivo. En los cultivos 2D, toda la superficie celular está directamente en contacto con el medio, alterando el crecimiento celular y modificando la disponibilidad de medicamentos. Además, la superficie de plástico no fisiológico desencadena la diferenciación celular1. Se han desarrollado modelos de cultivo tridimensionalparados para superar estas dificultades. Tienen la ventaja de imitar la arquitectura multicelular y la heterogeneidad de los tumores2,por lo que podrían considerarse un modelo más relevante para los tumores sólidos3. La compleja morfología de los esferoides contribuye a evaluar mejor la penetración y resistencia a los fármacos4. La heterogeneidad tumoral en el esferoide afecta a la difusión de oxígeno y nutrientes, y la respuesta a los agentes farmacológicos(Figura 1A). La difusión del oxígeno se altera cuando el tamaño de los esferoides alcanza los 300 m, induciendo un ambiente hipoxico en el centro del esferoide(Figura 1A,C). Los metabolitos también son menos penetrantes a través de las capas celulares y las reacciones metabólicas compensatorias tienen lugar5. Cuando aumenta el diámetro de la esferoide, se pueden observar núcleos necróticos, imitando aún más las características encontradas en muchos cánceres sólidos, incluyendo el glioblastoma agresivo del cáncer cerebral (GBM)6.
Varios ensayos de invasión 2D o 3D para el glioblastoma se han divulgado en la literatura7,8. Los ensayos bidimensionales son principalmente para estudiar la invasión en un plano horizontal en una capa de matriz delgada o en un ensayo de cámara Boyden9. Los ensayos tridimensionales se han descrito con cultivos de esferoides 3D utilizando líneas celulares clásicas de glioblastoma10. Variantes más complejas están representadas por la invasión de organoides cerebrales por esferoides tumorales en las culturas de confrontación11. Sin embargo, sigue siendo importante desarrollar un ensayo fácil de usar y reproducible disponible para cualquier laboratorio. Hemos desarrollado un protocolo para generar células similares a glioblastoma a partir de muestras de pacientes. La cuantificación de estos ensayos es fácilmente manejable y sólo requiere software en línea de acceso abierto. Brevemente, las piezas tumorales se cortan en trozos pequeños y se digieren enzimáticamente. Las células individuales derivadas de la digestión se cultivan en medio neurobasal. Después de 4-7 días, las estructuras esferoides se forman espontáneamente. Tras la implantación intracraneal en modelos de ratones, forman tumores que exhiben un núcleo necrótico rodeado de células pseudo-palisading12. Esto se asemeja mucho a las características encontradas en los pacientes con GBM.
En este artículo, describimos nuestro protocolo para producir esferoides a partir de un número determinado de celdas para garantizar la reproducibilidad. Para ello se pueden utilizar dos matrices complementarias: Matrigel y colágeno tipo I. Matrigel se enriquece en factores de crecimiento e imita la membrana basal de mamíferos necesaria para la unión celular y la migración. Por otro lado, el colágeno tipo I, un elemento estructural del estroma, es la matriz extracelular fibrilar más común y se utiliza en ensayos de invasión celular. Aquí, ilustramos nuestro modelo de esferoides GBM mediante la realización de ensayos de migración y proliferación. El análisis se realizó no sólo en puntos de tiempo fijos, sino también mediante el monitoreo de la expansión del esferoide y el movimiento celular mediante imágenes en vivo. Además, la microscopía electrónica se realizó para visualizar detalles morfológicos.
Los ensayos con esferoides tumorales están bien adaptados para estudiar las características tumorales, incluida la proliferación, la invasión y la migración, así como la muerte celular y la respuesta a las drogas. Las células cancerosas invaden la matriz 3D formando un microtumor invasivo, como se ve en la Figura 4B,C. Durante el proceso invasivo, las matrices de digestión de la matriz de metaloproteinasas (MMP) que rodean las células tumorales13</…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon es becario del Hospital Universitario de Toulouse (CHU Toulouse).
96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |