Murine Точность Cut печени фрагменты, как Ex Vivo Модель печени биологии
Summary
Этот протокол обеспечивает простой и надежный метод для производства жизнеспособных точных ломтиков печени от мышей. Образцы тканей ex vivo могут поддерживаться в условиях культуры лабораторных тканей в течение нескольких дней, обеспечивая гибкую модель для изучения патобиологии печени.
Abstract
Понимание механизмов повреждения печени, фиброза печени и цирроза печени, лежащих в основе хронических заболеваний печени (т.е. вирусный гепатит, безалкогольные жировые заболевания печени, метаболические заболевания печени и рак печени) требует экспериментальных манипуляций животных моделей и культур клеток in vitro. Оба метода имеют ограничения, такие как требование большого количества животных для манипуляции in vivo. Однако культуры клеток in vitro не воспроизводят структуру и функцию многоклеточной печеночной среды. Использование точно вырезанных ломтиков печени является методом, в котором единые ломтики жизнеспособной печени мыши поддерживаются в культуре лабораторных тканей для экспериментальных манипуляций. Этот метод занимает экспериментальную нишу, которая существует между исследованиями на животных и методами культуры клеток in vitro. Представленный протокол описывает простой и надежный метод изоляции и культуры точно вырезанных ломтиков печени от мышей. Как применение этого метода, ex vivo ломтики печени обрабатываются желчных кислот для имитации холестатической травмы печени и в конечном итоге оценить механизмы фиброгенеза печени.
Introduction
Патогенез большинства хронических заболеваний печени (т.е. вирусный гепатит, безалкогольный стеатогепатит, холестатическая травма печени и рак печени) включает в себя сложные взаимодействия между несколькими различными типами клеток печени, которые приводят к воспалению, фиброгенезу и развитию рака1,2. Чтобы понять молекулярные механизмы, лежащие в основе этих хронических заболеваний на основе печени, взаимодействия между несколькими типами клеток печени должны быть исследованы. В то время как несколько линий печеночных клеток (и в последнее время, органоиды) могут быть культивированы в пробирке, эти модели не точно эмулировать сложную структуру, функцию и клеточное разнообразие печеночной микросреды3. Кроме того, культивированные клетки печени (в частности, преобразованные клеточные линии) могут отклоняться от исходной биологии источника. Модели животных используются экспериментально для исследования взаимодействий между несколькими типами клеток печени. Тем не менее, они могут значительно сократить возможности для экспериментальных манипуляций, в связи со значительными внецелевых эффектов в внепеченных органов (например, при тестировании потенциальных терапевтических).
Использование точно вырезанных ломтиков печени (PCLS) в культуре тканей является экспериментальной техникой, впервые используемой в исследованиях метаболизма и токсичности наркотиков, и включает в себя резки жизнеспособных, ультратонких (около 100-250 мкм толщиной) ломтиков печени. Это позволяет прямое экспериментальное манипулирование ткани печени ex vivo4. Техника мосты экспериментальный разрыв между in vivo исследований на животных и in vitro клеточной культуры методов, преодоление многих недостатков обоих методов (т.е., практические ограничения на диапазон экспериментов, которые могут быть выполнены в целых животных, а также потеря структуры / функции и клеточного разнообразия с методами культуры in vitro клеток).
Кроме того, PCLS значительно увеличивает экспериментальные возможности по сравнению с целыми исследованиями на животных. Как одна мышь может производить более 48 ломтиков печени, это также облегчает использование как контроль и лечение групп из той же печени. Кроме того, методика физически отделяет ткани печени от других систем органов; Таким образом, он удаляет потенциальные вне целевых эффектов, которые могут возникнуть у целых животных при тестировании эффектов экзогенных стимулов.
В этом протоколе PCLS генерируется с помощью вибратом с боковой вибрирующим лезвием. Другие исследования успешно использовали слайсер ткани Krumdieck, как описано в Olinga и Schuppan5. В вибратоме боковая вибрация лезвия предотвращает разрыв ультратонкой ткани, вызванный стрессом сдвига, так как лезвие заталкивается в ткань. Оба вибратоми и Krumdieck ткани слайсер эффективно работать без структурного встраивания ткани печени, которая упрощает процедуру нарезки. Этот метод также может быть использован для создания PCLS из больной печени, в том числе из мышиных моделей фиброза / цирроза6 и печеночного стеатоза7.
В дополнение к демонстрации методов, необходимых для подготовки и культуры тканей PCLS, в этом докладе также рассматривается жизнеспособность этих экс-виво тканей путем измерения аденозин трифосфата (АТФ) уровней и изучения гистологии тканей для оценки некроза и фиброза. В качестве репрезентативной экспериментальной процедуры, PCLS лечатся патофизиологическими концентрациями трех различных желчных кислот (гликохобол, таурочич и холич) для имитации холестатической травмы печени. В контексте холестатической травмы печени, таурочохолная кислота, в частности, было показано, что значительно увеличилось как в сыворотке и желчи детей с муковисцидозом связанных заболевания печени8.
Клетки-прародители печени также лечились в пробирке с таурочольной кислотой для имитации повышенных уровней таурочоличной кислоты, наблюдаемых у пациентов, и это лечение вызвало повышенную пролиферацию и дифференциацию клеток-прародителей печени в сторону желчного (холангиоцита) фенотипа9. Впоследствии, PCLS были обработаны ex vivo с повышенным уровнем таурочоличной кислоты, и повышенные маркеры холангиоцита наблюдались. Это поддерживает наблюдения in vitro, что таурочохоловая кислота приводит к распространению и/или дифференциации в контексте детской муковисцидозной болезни печени9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол демонстрирует применение изоляции murine PCLS и культуры тканей, а процедуры предназначены для оценки жизнеспособности и полезности, а также для изучения воздействия экзогенных посредников печенской патобиологии с использованием биохимических анализов, гистологии и qPCR. Экспери?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана научно-исследовательскими грантами Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралии (Grant No. APP1048740 и APP1142394 в Г.А.Р.; APP1160323 в J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Грант А. Рамм поддерживается старшим научным сотрудником от NHMRC Австралии (Грант No. APP1061332). Мануэля Фернандеса-Рохо поддержала программа TALENTO Мадрида, Испания (T1-BIO-1854).
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta – Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
