Isolierung von Tonsillar Mononukleären Zellen zur Untersuchung von Ex-Vivo-angeborenen Immunantworten in einem menschlichen Mukosal-Lymphgewebe
Summary
Im vorliegenden Protokoll erklären wir, wie man mononukleäre Tonbandzellen von gesunden Menschen, die sich einer partiellen chirurgischen Tonsillektomie unterziehen, leicht verarbeitet und kultiviert, um angeborene Immunantworten bei aktivierung zu untersuchen und eine Virusinfektion in Schleimhautgeweben nachzuahmen.
Abstract
Die Untersuchung isolierter Zellen aus Mukosa-assoziierten Lymphgeweben (MALT) ermöglicht das Verständnis der Reaktion von Immunzellen in Pathologien mit Schleimhautimmunität, da sie Wirtspathogen-Wechselwirkungen im Gewebe modellieren können. Während isolierte Zellen aus Geweben das erste Zellkulturmodell waren, wurde ihre Verwendung vernachlässigt, da Gewebe schwer zu erhalten sein kann. Im vorliegenden Protokoll erklären wir, wie man mononukleäre Mandelzellen (TMCs) von gesunden menschlichen Mandeln leicht verarbeiten und kulturieren kann, um angeborene Immunantworten bei aktivierung zu untersuchen und eine Virusinfektion in Schleimhautgeweben nachzuahmen. Die Isolierung von TMCs von den Mandeln ist schnell, da die Mandeln kaum Epithel haben und bis zu Milliarden aller großen Immunzelltypen erwirtschaften. Diese Methode ermöglicht den Nachweis der Zytokinproduktion mit verschiedenen Techniken, einschließlich Immunoassays, qPCR, Mikroskopie, Durchflusszytometrie usw., ähnlich wie bei der Verwendung von peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus Blut. Darüber hinaus weisen TMCs eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteltests auf als PBMCs, die bei zukünftigen Toxizitätstests berücksichtigt werden müssen. Daher sind ex vivo TMCs Kulturen ein einfaches und zugängliches Schleimhautmodell.
Introduction
Studien an menschlichen Organen sind aufgrund der Zugänglichkeit sowie offensichtlicher ethischer Gründe eingeschränkt. Sie sind jedoch unerlässlich, um die Komplexität der menschlichen Biologie vollständig zu verstehen. Kulturen isolierter Zellen (Primärkulturen oder Zelllinien) sind aufgrund ihrer Verfügbarkeit ein Standardsystem in zellbiologischen Studien. Während isolierte Zellkulturen hervorragende Entdeckungen ermöglicht haben, ist die Verwendung von Zelllinien genauer unter die Lupe genommen worden, weil sie die in vivo Organbiologie nicht vollständig imitieren. Die Kultur der dreidimensionalen Zellen oder Gewebeexplanten ist jedoch hochkomplex4,5,6. Tatsächlich ist ein Stück Gewebe oder Organ sehr heterogen, da seine Zellzusammensetzung je nach Lokalisierung im Gewebe unterschiedlich ist. Daher erfordert die Verwendung von Gewebeblöcken die Analyse vieler technischer und biologischer Repliken, was zu einer großen Anzahl von Spendern oder Patienten führt.
Die Schleimhaut-assoziierten Lymphgewebe (MALT) sind strukturell den Lymphknoten ähnlich, haben aber einzigartige Funktionen, da ihre Hauptaufgabe darin besteht, die Schleimhautimmunität zu regulieren7. Im Gegensatz zu den Lymphknoten, die sich in der Regel in einiger Entfernung vom Gewebe befinden, befindet sich MALT in der Regel direkt unter dem Epithel des Schleimhautgewebes. Histologisch bestehen sie hauptsächlich aus hohen Konzentrationen von B- und T-Zellen, aber auch aus Antigen-präsentierenden Zellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen. MALT machen etwa 50% des Lymphgewebes im menschlichen Körper aus. MALT sind je nach Standort in neun Gruppen unterteilt: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (konjunktiv), LALT (Larynx-), SALT (skin-), VALT (vulvo-), O-MALT (organisiert) und D-MALT (diffus). Der O-MALT besteht hauptsächlich aus den Mandeln des Waldeyer Tonsillar-Rings und ist der zugänglichste MALT8,9. Tatsächlich stellen Mandeln im Oropharynx die Hauptbarriere zum Schutz der Verdauungs- und Atemwege vor (potenziellen) invasiven Mikroorganismen10dar. Darüber hinaus werden die Mandeln von einem fein geschichteten Plattenepithel ohne Keratinisieren bedeckt, das von einer Kapsel aus Bindegewebe unterstützt wird, die Blutgefäße, Nerven und Lymphatik enthält und einen einfachen Zugang zu den Immunzellen11,12ermöglicht. Darüber hinaus ist die Tonsillektomie, der chirurgische Akt der Entfernung von Mandeln, ein häufiges Verfahren, das bei Kindern mit schlafgestörter Atmung durchgeführt wird, wodurch Mandelnin physiologischen Umgebungen leicht zugänglich sind.
Tonsillen ermöglichen die Untersuchung der Immunzellreaktion in Pathologien mit Schleimhautimmunität. In der Tat, bei HIV-Infektion, weil Mandeln aus einer hohen Konzentration von Immunzellen bestehen, sind sie das Hauptziel der Virusreplikation, sondern produzieren auch eine große Menge an Zytokinen, die nicht im Kreislauf14,15nachgewiesen werden. In stabilen Zuständen sind seltene Populationen von angeborenen Zellen in verschiedenen Schleimhautgeweben vorhanden, einschließlich der Mandeln, aber im Wesentlichen fehlen im Blut.
Daher sind mononukleäre Zellen aus Mandeln (TMCs) ein relevanteres und komplexeres Modell als PBMCs und können tiefergehende Fragen beantworten. Andererseits kann die Verwendung von Gewebeexplantationen komplex und nicht immer relevant für angeborene Immunstudien sein. So haben wir ein Modell zur Untersuchung der Mukosal-Immunaktivierung mit TMCs16erstellt. Hier beschreiben wir eine Methode zur effizienten Isolierung von TMCs von frischen menschlichen Mandeln. Diese Methode ermöglicht die Wiederherstellung einer großen Anzahl von Immunzellen unter Beibehaltung ihrer Integrität für Ex-vivo-Studien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menschliche Mandeln stellen ein integratives und physiologisches Ex-vivo-Modell dar, um angeborene Immunantworten an der Schleimhautschnittstelle zu untersuchen, da sie die Rolle eines sekundären Lymphorgans imitieren. Interessanterweise ist die zelluläre Zusammensetzung der TMCs den PBMCs ähnlich und umfasst alle wichtigen Zellpopulationen, obwohl ihr Prozentsatz von PBMCs aus Blut abweichen kann (Abbildung 1). Zusätzliche Populationen können auch gefunden werden, da alle Immunantworte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) für die Experimente und Das N.B.-Stipendium (AAP 2017 166). N.S. unterstützt das ANRS für Stipendien (AAP 2016 1), die European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), das Startup-Förderprogramm “Baustein” der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm (LSBN.0147) und die Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
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