在这里,我们提出了一个协议,以测量eIF4E-eIF4G在活细胞中的相互作用,使用户能够评估药物引起的扰动eIF4F复杂动态的筛选格式。
eIF4F复合物的形成已被证明是信号通路收敛的关键下游节点,这些信号通路经常在人类中经历致癌活化。eIF4F 是一个上限绑定复合体,涉及翻译启动的 mRNA – 相关招聘阶段。在许多癌症的细胞和临床前模型中,eIF4F 的放松管制导致参与癌症增殖和生存的特定 mRNA 子集的翻译增加。eIF4F 是一个由上限绑定子单位 eIF4E、六角酶 eIF4A 和脚手架子单元 eIF4G 构建的异质三元复合体。活性eIF4F复合物组装的关键在于eIF4E和eIF4G蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用。在本文中,我们描述了一个测量 eIF4F 组件的协议,该程序可监控活细胞中的 eIF4E-eIF4G 交互状态。eIF4e:4G 基于细胞的蛋白质-蛋白质相互作用检测还允许准确可靠地评估 eIF4F 复杂完整性的药物诱导变化。我们设想,这种方法可以应用于验证市售化合物的活性,或进一步筛选有效破坏eIF4F复合物形成的新化合物或方式。
基因表达控制在正确执行细胞程序(如生长增殖和分化)方面起着至关重要的作用。监管控制机制可以在基因转录水平或mRNA转化水平上进行。在过去十年中,越来越明显的是,通过调节启动过程而不是后来的拉长和终止步骤进行转化控制,可以精细地调节具有广泛生物功能的蛋白质特定子集的合成。
参与生存、抗自噬和抗凋亡反应的 mRNA 的翻译增加与几种癌症有关,并且与异常激活或过度表达翻译启动因子1有因果关系。
eIF4F 综合体是翻译启动的主调节器。通过将上限结构与 mRNA 的 5′ 端绑定,eIF4F 正在推动初始 mRNA-里博索姆的招聘,进而提高翻译不力的真核素 mRNA2的 mRNA 翻译效率。据报道,许多癌症模型都存在异常激活RAS/MAPK或AKT/TOR通路的癌症模型,eIF4F的中介翻译,这表明癌细胞会调节eIF4F,以增强自身的抗肿瘤活性。通过抑制eIF4F复合形成来破坏这个进气回路,因此是一个非常有希望的治疗策略3,4。
eIF4F 综合体由 (i) eIF4E 组成, eIF4F 的帽绑定子单位,与 mRNA 的 5′ UTR、(ii) eIF4A、RNA 六氯酶和 (iii) eIF4G 的上限结构相互作用,后者是与 eIF4A 和 eIF4E 相互作用的脚手架蛋白,最终招募了 40S 核糖核酸亚单位5。eIF4G 与 eIF4E 关联是功能 eIF4F 复合体组装的限速步骤,由 eIF4E 结合蛋白(4EBP、成员 1、2 和3)6负调节。通过由规范和非规范 eIF4E 绑定序列7、8、9(人类 eIF4E 上的 aa 604-646 区域)组成的界面与 eIF4G 绑定竞争,4EBP 可减少积极参与翻译和防止 eIF4F 复杂形成的 eIF4E 池。这些蛋白质-蛋白质相互作用的相互作用主要受4EBP的拉帕霉素(mTOR)介质磷酸化的哺乳动物目标的调节。在偏头痛刺激下,mTOR直接磷酸化4E-BP蛋白家族的成员,减少他们与eIF4E的关联,从而促进eIF4E-eIF4G相互作用和功能eIF4F复合体10的形成。
尽管在开发针对eIF4F复合完整性的化合物方面付出了巨大努力,但缺乏测量活细胞中eIF4E-eIF4G相互作用直接中断的检测结果,限制了对细胞活性命中化合物的搜索。我们应用了基于共聚苯乙烯模拟(例如,基于纳诺鲁克的补充测定)的路西法酶检测,通过 eIF4E-eIF4G 交互实时监控 eIF4F 完整性的状态。路西法酶补充蛋白系统由18kDa蛋白片段(SubA)和11氨基酸肽片段(SubB)组成,优化为最小的自结和稳定性11。一旦表示为与人类全长eIF4E和eIF4E相互作用域从人类eiF4G1(aa 604-646)的融合产品,两种相互作用的蛋白质将把SubA和SubB片段彼此接近,并诱导形成活性荧光酶,当细胞渗透基质存在时,最终将产生明亮的发光信号(图1)。我们已在其他地方报告了eIF4E:eIF4G604-646 补充系统16的建设和验证情况。
在这里,我们描述了如何应用 eIF4E:eIF4G604-646 补充系统(可应要求提供)来准确测量活细胞中 4EBP1 介质的 eIF4E-eIF4G 中断。此外,我们通过测量目前作为潜在的癌症治疗药物12的临床试验中的几种mTOR抑制剂的效果来证明它的效用。由于目标外效应通常掩盖药物特异性活动,我们还描述了如何通过细胞生存能力正交测量来扩展 eIF4E:eIF4G604-646 系统测量的多功能性。
本文所述方法采用基于路西法酶的补充测定法,通过直接测量活细胞中的eIF4G-eIF4E相互作用,对eIF4F复合组件进行定量监测。我们提供了使用eIF4E-eIF4G补充系统的详细信息,也表明该系统在测量eIF4E-eIF4G相互作用16的药物诱导4EBP1介导分离方面非常准确。为了便于此检测的吞吐量,本文中描述的实验设置已设计为 96 井微板格式的使用。
为了获得最佳结果,在执?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了p53lab(BMSI、A*STAR)和JCO VIP赠款(A*STAR)的核心预算的支持。
293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |