Summary

Идентификация нейтрофилов Внеклеточных Ловушек в Параффина-embedded Feartline артериальных тромби с использованием иммунофлюоресценционной микроскопии

Published: March 29, 2020
doi:

Summary

Мы описываем метод выявления нейтрофилов внеклеточных ловушек (NETs) в формальдегид-фиксированной и парафина встроенных кошачьих кардиогенных артериальных тромбов с использованием тепло-индуцированного антигена поиска и двойной иммуномаркировки протокола.

Abstract

Нейтрофил внеклеточных ловушек (NETs), состоящий из клеточной ДНК (cfDNA) и белков, как гистоны и нейтрофил эластаза (NE), высвобождаются нейтрофилов в ответ на системное воспаление или патогенов. Хотя ранее было показано, что NETs увеличивают образование тромбов и подавляют фибринолиз у людей и собак, роль NETs у кошек с кардиогенной артериальной тромбоэмболией (CATE), опасным для жизни осложнением, вторичным по отношению к гипертрофической кардиомиопатии , неизвестно. Стандартизированный метод для выявления и количественной оценки NET в кардиогенных артериальных тромбов у кошек будет способствовать нашему пониманию их патологической роли в CATE. Здесь мы описываем метод выявления NETs в формальдегид-фиксированной и парафина встроенных тромбо в аортальной бифуркации, извлеченные во время некропсии. После депарафинизации с ксиленом, аортальные секции прошли непрямой тепло-индуцированного антигена поиска. Разделы были затем заблокированы, permeabilized, и ex vivo NETs были определены путем coлокализации клеточной ДНК (cfDNA), цитруллинированный гистон H3 (citH3), и нейтрофил elastase (NE) с использованием иммунофлюоресценции микроскопии. Для оптимизации иммунообнаружения NETвов в тромби, аутофлуоресценция элементов ткани была ограничена с помощью процесса закалки аутофлюоресценции до микроскопии. Этот метод может быть полезным инструментом для изучения NETs и тромбоза в других видах и предлагает новые идеи в патофизиологии этого сложного состояния.

Introduction

Кошки с гипертрофической кардиомиопатией подвергаются риску опасных для жизни тромбоэмболических осложнений1,,2. Несмотря на высокую заболеваемость и смертность, связанные с кошачьей кардиогенной тромбоэмболией (КАТЭ), лежащая в основе патофизиология CATE у кошек плохо понимается. Есть также ограниченные диагностические и терапевтические инструменты для лечения и выявления кошек, подверженных риску этого разрушительного состояния3.

В дополнение к своей роли в врожденном иммунитете, нейтрофилы, как было показано, играют роль в тромбозе, выпустив нейтрофил внеклеточных ловушек (NETs), которые веб-подобных сетей клеточной ДНК (cfDNA) инкрустированы гистонами и гранулированных белков, как нейтрофил эластазы (NE) и миелопероксиды. Нейтрофилы проходят образование NET в ответ на системное воспаление, прямое столкновение с патогенными микроорганизмами, а также взаимодействие с активированными тромбоцитами4,,55,6,,7. У собак днк, полученная из нейтрофилов, подавляет лизис тромбов, в то время как протеины NET ускоряют образование тромбов. Способность NETs улавливать циркулирующие клетки и компоненты коагуляции также является ключом к их тромбогенным свойствам8,,9,,10,,11,,12.

NET обнаруживаются путем колокализации внеклеточных нейтрофильных белков, гистонов и cfDNA. Из-за этого, выявление и количественное определение NETs в фиксированных тканях иммунофлуоресценции депарафинизированных тканей превосходит традиционные гематоксилин и эозин (H и E) пятно с использованием яркой микроскопии поля4,5. Несколько человеческих исследований с использованием иммунофлуоресценционной микроскопии определили NETs как структурные компоненты коронарных артериальных тромбов, тромбов мозгового инсульта, атеротромбоза и венозной тромбы13,14,16,,17.17 На сегодняшний день не описан стандартизированный метод выявления и количественной оценки NET в кошачьих тромби. Поскольку выявление NET s в кошачьих кардиогенных артериальных тромбов может облегчить будущие трансляционные исследования в NETs и тромбоз, мы описываем методы net идентификации и оценки в парафинавстроенных артериальных тромбов у кошек.

Protocol

Все описанные здесь методы были выполнены в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе. Некропсии и биопсии тканей проводились с согласия владельцев. 1. Фиксация тканей…

Representative Results

Используя этот протокол для депарафинизации, теплового антигена поиска, и двойной иммуномаркировки парафина встроенных тромбов, мы определили NETs в кошачьих CATE в первый раз. Тромби в аортальной бифуркации были обнаружены флуоресценцией микроскопии и яркой полевой микроскопией с испол…

Discussion

Мы описываем протокол для выявления NETs в фиксированной кошачьей кардиогенных тромбов с помощью двойного протокола иммуномаркировки и иммунофлуоресценции микроскопии. Хотя только кардиогенные артериальные тромбы были окрашены, в теории этот протокол может быть использован для други…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследование было поддержано фондами Калифорнийского университета в Дэвисе, Центра здоровья животных (CCAH 2018-30-F). Авторы хотели бы отметить д-р Кевин Вулард для использования флуоресценции микроскопа.

Materials

4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate ThermoFisher Scientific Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x ThermoFisher Scientific AMEP4681 NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x ThermoFisher Scientific AMEP4682 NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x ThermoFisher Scientific AMEP4699 NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher Scientific Catalog # A32723
Goat serum Jackson Immuno Research Labs Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody Bioss Antibodies Bs-6982R-Biotin Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40 Pierce Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides Thomas Scientific Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum Life Technology Catalog # 10510
Target Retrieval Solution Agilent Dako S2367 TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit Vector Laboratories SP-8400

References

  1. Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).
  2. Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
  3. Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
  4. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  5. Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
  6. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  7. Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
  8. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  9. Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
  10. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
  11. Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
  12. Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
  13. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  14. Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
  15. Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
  16. Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
  17. Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  18. Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
  19. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  20. Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
  21. Rait, V. K., Xu, L., O’Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
  22. Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
  23. Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
  24. Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
  25. Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
  26. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  27. Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
  28. Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).

Play Video

Cite This Article
Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (157), e60834, doi:10.3791/60834 (2020).

View Video