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Summary
Abstract
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Immunology and Infection

フローサイトメトリーを用いた赤血球補体受容体1の測定

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/60810
, , , , ,
1Oncogeriatric Coordination Unit,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform,University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology,Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

この方法の目的は、赤血球CR1密度が知られている3人の被験者と比較することによって、任意の被験体の赤血球中のCR1密度を決定することである。この方法は、フィコエリスリン(PE)を用いて増幅系に結合した抗CR1モノクローナル抗体による被験者の赤血球の免疫染色後のフローサイトメトリーを使用する。

Abstract

CR1(CD35、C3b/C4b用補体受容体1型)は、約200kDaの高分子膜糖タンパク質であり、補体活性化を制御し、免疫複合体を輸送し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。CR1は、赤血球を含む多くの細胞型の表面に存在し、長さ、構造(Knops、またはKN、血液群)、および密度において多型を示す。赤血球当たりのCR1(CR1/E)の平均密度は、赤血球当たり500分子である。この密度は、ある個体(100~1,200 CR1/E)、同一個体の赤血球から別の赤血球へと変化する。ここでは、増幅免疫染色システムの助けを借りて、低密度を発現する被験者を含むCR1/Eの密度を測定する堅牢なフローサイトメトリー法を提示する。この方法により、アルツハイマー病(AD)、全身性エリテマトーシス(SLE)、エイズ、マラリアなどの疾患におけるCR1赤血球発現の低下を示す。

Introduction

CR1(補体受容体型1、CD35)は、赤血球1、Bリンパ球2、単球細胞、一部のT細胞、濾胞樹状細胞3、胎児アストロサイト4、および糸球体ポドサイト5のような多くの細胞型の表面に存在する200kDa膜貫通糖タンパク質である。CR1は、そのリガンドC3b、C4b、C3bi6、7、8、9、第1の補体成分のサブユニット、C1q6,7,8,910およびMBL(マンナン結合レクチン)11は、補体の活性化を阻害し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。

ヒトを含む霊長類において、赤血球CR1は、肝臓および脾臓への免疫複合体の輸送に関与し、血液を浄化し、皮膚または腎臓12、13、14,13,14などの脆弱な組織に蓄積するのを防ぐ。免疫複合体と赤血球との間の免疫接着のこの現象は、CR1分子15の数に依存する。ヒトでは、CR1/Eの平均密度はわずか500(すなわち、赤血球当たりCR1の500分子)である。この密度は、ある個体(100~1,200 CR1/E)、同一個体の赤血球から別の赤血球へと変化する。”null” 表現型の一部の個体は、20 CR1/E16未満を表現する。

CR1/Eの密度は、CR1*117、18,18に対してコードする遺伝子のイントロン27における点突然変異に結合した2つの共支配性常染色体対立遺伝子によって調節される。この変異は、HindIII酵素に対する追加の制限部位を生成する。この場合のHindIIIでの消化後に得られた制限フラグメントは、CR1(H:高アレル)の強い発現にリンクされたアレルの7.4kb、低CR1発現にリンクされたアレルの6.9kb(L:低アレル)である。このリンクは白人やアジア人に見られますが、アフリカ系の人々には見られません19.

赤血球CR1の発現レベルは、SCR10をコードするエキソン13(I643T)およびExON 19コードSCR16(Q981H)におけるポイントヌクレオチド突然変異の存在とも相関している。ホモ接合643I/981Qでは高く、ホモ接合体643T/981H個体20では低い。したがって、「低い」個体は約150 CR1/Eを表現し、「中程度」の個体は約500のCR1/Eを表現し、「高い」個体は約1,000 CR1/Eを表現する。

この赤血球密度多型に加えて、CR1は、異なるサイズの4つの異なる異形型に対応する長さの多形によって特徴付けられる:CR1*1(190 kDa)、CR1*2(220kDa)、CR1*3(160kDa)、およびCR1*4(250 kDa)21と抗原多型の22に対応する。21

CR1/Eの密度が既知の3つの被験者を用いて、CR1/Eの密度を決定するためのフローサイトメトリーに基づく方法を提示します。 低密度レベル(180 CR1/E)、中密度レベル(646 CR1/E)、高密度レベル(966 CR1/E)を発現し、赤血球または赤血球(RBC)の平均蛍光強度(MFI)、またはRBC MFIを測定することは容易です。その後、MFI を CR1/E 密度の関数として表す標準線をプロットできます。CR1/E密度が知られていない被験者のMFIを測定し、これをこの標準線と比較して、個人のCR1/E密度を決定することができる。この技術は、研究室で長年使用されており、全身性エリテマトース(SLE)23、後天性免疫不全症候群(AIDS)24、マラリア25、および最近アルツハイマー病(AD)26、27など多くの病態において、赤血球CR1の発現の低下を検出することを可能26に27している。23抗血栓薬28の場合のように、赤血球と結合するCR1を標的とする薬物の開発は、CR1/E密度の評価、およびCR1を定量化するための堅牢な技術の入手可能性を必要とする。

提示されたプロトコルは、1回で実行されます。特定の市販の96ウェルプレートを使用して多くの個人のCR1/Eの密度を決定するために適応可能です(材料表を参照)。この上で、それは任意の96ウェルプレートに私たちの方法を適応させることは容易です。各サンプルについて、赤血球の細胞懸濁液(0.5 x 106-1 x 106赤血球)がウェルごとに分布する。各井戸に対して、最初の一次抗CR1抗体を添加し、次にストレプトアビジンPE、二次抗ストレプトアビジン抗体、および再びストレプトアビジンPEを、我々の方法のものと同じ希釈を用いるが、体積を適応させ、比例性を尊重することによって。

CR1の範囲の被験者および被験者から採検される被験者からの血液サンプルは、同時に採取し、4°Cの冷蔵庫に保存し、4°C(氷上および/または冷蔵庫)で取り扱う必要があります。

Protocol

ヒトの採血と取り扱いの議定書は、地域倫理委員会(CPP Est II)によって審査され、承認され、プロトコル番号は2011-A00594-37です。以下のプロトコルは、ヒトの血液の取扱いについて説明しているので、生体有害物質の廃棄に関する制度上のガイドラインに従うべきである。ラボコートや手袋などの実験室の安全装置を着用する必要があります。 1. 赤血球洗浄 <p class="jove_con…

Representative Results

CR1の密度が知られている3人の被験者の赤血球(“低”被験者[180 CR1/E]、中型の被験者[646 CR1/E]、および「高」被験者[966 CR1/E])、およびCR1密度を決定する必要がある2つの被験者の赤血球は、フィロクロム系を用いて免疫染色された。初めに、低い高い範囲からの被験者のCR1密度は、放射線標識抗体を用いてScatchard法29によって決定された。測定された基準(低、中、高)は、較正曲線…

Discussion

赤血球CR1(CR1/E)の密度を決定するためにいくつかの技術が利用可能です。第1の技術は、抗CR1抗体31による赤血球の凝集と、C3b32でコーティングされた赤血球の存在下でのロゼットの形成であった。32これらの初歩的な技術は、放射性標識抗CR1抗体11、3333を用いた免疫染色法によって迅速に置換された。また、酵素結…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

URCACyt、フローサイトメトリー技術プラットフォームのメンバー、免疫学科のスタッフ、およびプロトコルの最適化と検証に貢献した内科学・老年医学省のスタッフに感謝します。この研究はランス大学病院(助成金番号AOL11UF9156)によって資金提供されました。

Materials

1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman – type M25 – Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
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References

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Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).
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