Коррекция хроматических сдвигов в трехмерных (3D) многоцветных флуоресценции микроскопических изображений имеет решающее значение для количественного анализа данных. Этот протокол разработан для измерения и коррекции хроматических сдвигов в биологических образцах путем приобретения подходящих справочных изображений и обработки с открытым исходным кодом программного обеспечения, Chromagnon.
Количественная многоцветная флуоресценция микроскопия опирается на тщательное пространственное сопоставление цветных каналов, приобретенных на разных длинах волн. Из-за хроматической аберрации и несовершенного выравнивания камер изображения, полученные в каждом канале, могут быть сдвинуты и увеличены, а также повернуты по отношению друг к другу в любом из трех измерений. С помощью классического метода калибровки хроматические сдвиги измеряются многоцветными бусинками, прикрепленными к поверхности крышки, и имеется ряд программ для измерения хроматических сдвигов от таких образцов калибровки. Тем не менее, хроматической аберрации может варьироваться с глубиной, изменения с условиями наблюдения и быть вызваны биологическим образцом себя, тем самым препятствуя определению истинного количества хроматических сдвиг в образце интереса и по объему. Исправление хроматических сдвигов с более высокой точностью особенно актуально для микроскопии супер-разрешения, где только незначительные хроматические сдвиги могут повлиять на количественный анализ и изменить интерпретацию многоцветных изображений. Мы разработали программное обеспечение с открытым исходным кодом Chromagnon и сопутствующие методы для измерения и коррекции 3D хроматических сдвигов в биологических образцах. Здесь мы предоставляем подробный протокол применения, который включает в себя специальные требования для подготовки образца, получения данных и обработки программного обеспечения для измерения хроматических сдвигов в биологических образцах, представляющих интерес.
Многоцветная визуализация является одним из основных аспектов биологической флуоресценции микроскопии, в тех случаях, когда пространственные отношения различных молекул или структур представляет большой интерес. Хроматическая аберрация, оптическая аберрация полихроматического света, вызванного дисперсией, изменяет очевидное положение цветных объектов, представляющих интерес. Аналогичным образом, микроскопы, оснащенные несколькими камерами, предназначенными для приобретения каждого цвета, имеют более сложные хроматические сдвиги из-за различий в оптических элементах и несовершенном выравнивании между каналами. Таким образом, такие хроматические сдвиги могут привести к ложному выводу, если они не будут явно исправлены пользователем. Хотя хроматические сдвиги не были серьезной проблемой до тех пор, пока разрешение микроскопии ограничено классическим ограничением разрешения, недавняя разработка микроскопии супер-разрешения1 вызвала необходимость более точной коррекции хроматических сдвигов.
Это была обычная практика для измерения хроматических сдвигов микроскопических систем с помощью многоцветной шариковой калибровки слайд2. Метод калибровки на основе бисера подходит для измерения хроматических сдвигов от всей оптики микроскопа к поверхности крышки2. Этот метод, однако, не в состоянии измерить хроматические сдвиги в биологических образцах, представляющих интерес. Важно отметить, что многие биологические образцы являются трехмерными (3D), а хроматические сдвиги таких образцов отличаются от образцов на поверхности крышки. Кроме того, хроматические сдвиги меняются с условиями визуализации2,,3. Мы измерили хроматические сдвиги в 3D биологических образцах и обнаружили, что неопределенность хроматических сдвигов часто составляла 350 нм классическим методом калибровки многоцветного шарика3. Поэтому хроматические сдвиги должны измеряться в биологических образцах на глубине интереса и в условиях визуализации, используемых.
Здесь мы описываем процедуры для измерения хроматических сдвигов в биологических образцах и коррекции этих сдвигов с помощью нашего программного обеспечения, Chromagnon3. Для измерения хроматических сдвигов в биологических образцах наш метод использует два вида наборов данных: “целевое” изображение и “справочное” изображение. Изображение “цель” представляет собой многоцветное изображение, представляющий интерес, например, изображения, окрашенные для ДНК, ядерного конверта и микротрубочек. Часто невозможно измерить хроматические сдвиги в таком изображении. Поэтому нам нужен «справочное» изображение, предназначенное для измерения хроматических сдвигов в образце. Единственным определением «справочного» изображения является многоцветное изображение одного и того же объекта. В этом смысле, многоцветное изображение бисера также является одним из видов эталонного изображения. Здесь мы описываем три различных типа эталонного изображения, которые используются для измерения хроматических сдвигов в биологических образцах: “перекрестные справочные изображения”, “ярко-полевые справочные изображения” и “биологические калибровочные справочные изображения”. Тип эталонного изображения зависит от типа используемого микроскопа или требуемой точности коррекции, как кратко изложено в таблице 1.
Перекрестный разговор | Яркое поле | Биологическая калибровка (на другом слайде) | Биологическая калибровка (на том же слайде) | |
Точностьa | +++ | + | Вб | +++ |
Простота | ++ | +++ | ++ | ++ |
Применимая микроскопия | Широкое поле | Широкое поле | Все | Все |
Наличие локального выравнивания | + | + | –c | –c |
a: Количество “я” указывает на повышение рейтинга. Одноместный плюс составляет около 50 нм и три плюс составляет около 15 Нм в 3D. b: Точность зависит от того, насколько переменные условия визуализации остаются неизменными. c: Локальная калибровка, измеряемая образцами разноцветных шариков, может быть объединена, как описано в разделе протокола 4. |
Таблица 1: Параметры при выборе типа эталонных изображений.
“Crosstalk справочные изображения” имеют самую высокую точность коррекции и относительно просты для выполнения3,4 (Таблица 1). Недостатком является их ограничение в приложениях микроскопии из-за их неспособность измерения хроматических сдвигов в путях возбуждения. Кроме того, для получения таких изображений, микроскоп должен быть оснащен мультиполосными дихроическими зеркалами и фильтрами выбросов, которые независимо контролируются фильтрами возбуждения или источниками света. Подходящая микроскопия включает в себя обычную широкополую микроскопию, однополую локализацию микроскопии (SMLM), такую как фотоактивная локализация микроскопии/стохастической оптической реконструкции микроскопии (PALM/STORM)5,6 и микроскопия расширения7 наблюдается с широкополой микроскопией. Справочное изображение crosstalk приобретается из самого целевого образца. Это изображение перекрестного разговора (кровотечения через) флуоресценции красителя, полученные во всех необходимых каналов. Выбросы флуоресценции всегда расширяется в сторону более длинных длин волн, поэтому красители с кратчайшей длиной волны выбросов возбуждаются, чтобы получить флуоресценцию поперечного запаха в каналах более длинных длин волн. Например, когда образец окрашен синим, зеленым и красным цветом, только синий краситель возбуждается, а свет излучения получается в синем, зеленом и красном каналах. В этом протоколе, ДНК окрашенных с 4 , 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) был использован для получения перекрестного флуоресценции.
“Яркие-поле справочные изображения” являются проще и менее фототоксичной альтернативой “перекрестный ссылка изображения”, но наименее точные3 (Таблица 1). Это яркие полевые изображения целевого образца, приобретенные во всех цветных каналах, используемых в целевом изображении.
“Биологические калибровочные справочные изображения” имеют то преимущество, что применимы к любому типу микроскопии из-за их способности измерять хроматические сдвиги как в возбуждении, так и в путях излучения3,,8 (Таблица 1). Подходящая микроскопия включает широкополую микроскопию, конфокальную микроскопию, микроскопию светового листа, стимулируемое истощение выбросов (STED)9,структурированную микроскопию освещения (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM наблюдается с общим внутренним отражением флуоресценции (TIRF) режим, Olympus супер разрешение (OSR)13, и так. Биологическое калибровочное справочное изображение получено из образца калибровки, аналогично подготовленного в качестве целевого образца, но с окрашиванием одной структуры с несколькими цветами. Точность коррекции превосходит разрешение большинства микроскопии супер-разрешения и подготовка образца биологической калибровки может быть относительно простым. Другим преимуществом является наличие “средних” нескольких справочных изображений. Поэтому, несмотря на то, что отдельные изображения содержат плохую информацию для измерения хроматических сдвигов, содержание информации может быть увеличено за счет усреднения нескольких изображений. Точность зависит от того, насколько условия визуализации остаются неизменными. В этой связи наилучшие показатели получаются, когда образцы цели и ссылки находятся на одном слайде, используя, например, 8-хорошо камерные очки покрытия(Таблица 1, право-большинство). В этом протоколе в качестве биологической калибровки использовался актин, окрашенный тремя цветами фаллоидинов.
Как только эталонное изображение получено, то хроматический сдвиг измеряется и корректируется нашим программным обеспечением Chromagnon. Существует никаких ограничений на количество каналов, разделов и временных рамок, что Chromagnon может измерить и исправить хроматические сдвиги для. Chromagnon измеряет хроматические сдвиги в два шага. Первый шаг приобретает параметры выравнивания «глобального» или «аффина» в x, Y, оси, увеличение вдоль оси X, Y, и вращение вокруг оси « з». Точность расчета глобального выравнивания составляет 16 нм в 3D и 8 нм в 2D. Вторым шагом является факультативное 2D итеративное “локальное выравнивание” на проецируемых изображениях для получения более высокой точности. В процессе локального выравнивания изображения подразделяются на несколько областей и измеряются хроматические сдвиги в этих локальных регионах. Впоследствии регионы еще больше разделены, и хроматические сдвиги в субрегионах измеряются итеративно до тех пор, пока количество пикселей в регионе не достигнет минимального количества пикселей (обычно 60 х 60 пикселей). Полученная локальная карта выравнивания сочетается с глобальным параметром выравнивания и применяется к целевому изображению путем упругой трансформации. После этого шага точность расчета повышается до 14 нм в 3D и 6 нм в 2D. Локальное выравнивание не подходит для биологических калибровочных справочных изображений, поскольку биологическая структура в справке отличается от той, которая есть в целевом (Таблица 1). Поэтому для биологических калибровочных эталонных изображений используется только глобальное выравнивание.
Местные хроматические сдвиги происходят из двух источников; микроскоп инструментальные локальные искажения и биологические структурные inhomogeneity. Поскольку микроскоп инструментальных локальных искажений является постоянным, это может быть измерено из многоцветных бусин эталонных образцов и исправлено в качестве фиксированного параметра. Chromagnon может объединить микроскоп инструментальные локальные искажения карты и глобальные параметры выравнивания от биологических калибровки (Таблица 1). С помощью этого метода ожидается, что средняя точность биологической калибровки будет улучшена еще на 1–2 нм.
Здесь мы описываем протокол для коррекции хроматических сдвигов 3D флуоресценции изображений с помощью нашего программного обеспечения Chromagnon, от самого простого низкого конца до самой высокой точности. В качестве примера мы используем иммуносхуалирование клеток HeLa и наблюдаем их с помощью 3D широкополой микроскопии и 3D-SIM. В первом разделе мы описываем, как подготовить образцы мишеней и образцы биологической калибровки. Эта часть протокола должна быть оптимизирована для конкретных целей исследования. Во втором разделе мы описываем методы приобретения трех видов эталонных изображений с помощью микроскопов. Предполагалось получить синий, зеленый и красный каналы, но состав канала должен быть изменен конкретными целями исследования и установками микроскопа. Это не имеет значения, если микроскоп оснащен одной камерой или несколькими камерами. В третьем разделе мы описываем, как можно использовать наше программное обеспечение для измерения и коррекции хроматических сдвигов целевого изображения с помощью эталонных изображений. Наконец, в четвертом разделе мы описываем метод, дополняя биологические калибровочные справочные изображения с помощью инструментальной локальной калибровки микроскопа.
Процедура хроматической коррекции является компромиссом между точностью и усилием. Чтобы сэкономить ненужные усилия, лучше знать, сколько точности требуется для вашего исследования. Для обычной широкоугольной (живой) визуализации может не потребоваться высокая точность, и, таким образом, ярких полевых справочных изображений часто достаточно для коррекции хроматического сдвига. Аналогичным образом, когда состояние изображения и окружающая среда постоянна, повторное использование биологической калибровки сэкономит время. С другой стороны, при желаемой высокоточной регистрации необходимы высококачественные перекрестные или биологические калибровочные справочные изображения. Для наилучшей производительности, справочные изображения должны быть получены с такими же условиями и таймингами, как целевые изображения, как это возможно. До тех пор, пока и эталонные, и целевые изображения получаются с помощью одной микроскопии, более высокое пространственное разрешение повысит точность коррекции. Если деконволюция доступна как для эталонных, так и для целевых изображений, то реализация этого перед коррекцией может повысить точность коррекции. Кроме того, для наилучшей производительности теорема выборки для оптической оси (я) должна быть выполнена как в справочном, так и в целевом файле для точной субпиксельной интерполяции (протокол шаг 2.1.3).
Неспособность исправить хроматический сдвиг приводит к неправильным выводам. Кроме того, использование неправильной калибровки может даже ухудшить хроматические сдвиги, а не исправление их, и поэтому этого следует избегать. Мы обобщили возможные причины сбоев и их общие решения в таблице 2. Чтобы изучить причину сбоя, в первую очередь, необходимо визуально проверить, точно ли исправлена хроматическая сдвиг в эталонном изображении (протокол шаг 3.12). Большинство сбоев обусловлены качеством справочных изображений и легко устраняются в соответствии с описаниями в таблице 2. Что касается качества справочных изображений, важно отметить, что точность глобального выравнивания уменьшается, если все поле зрения не заполнено образцом(рисунок 7, Таблица 2). По сравнению с хорошим примером, показанным на рисунке 7A,плохой пример, показанный на рисунке 7B, содержит только три ядерных оболочки в верхнем левом регионе, и Chromagnon не удалось выровнять часть этого изображения. Это потому, что глобальный метод выравнивания Chromagnon делит поле зрения на четыре региона(рисунок 7C) для того, чтобы измерить различия в вращении и увеличении с высокой точностью3. Этот метод, при правильном управлении, является одним заказом более точным, чем другие линейные методы, такие как преобразование полярная журнал и методы простого3. Если какой-либо из четырех регионов недоступен, то Chromagnon перейдет на менее эффективные линейные методы. Поэтому для наилучшей производительности примеры, приведенные на рисунке 7B и рисунке 7C, являются нежелательными, а четыре области должны быть заполнены объектами. Пользователи могут проверить, недоступна ли какая-либо квадратная область поля зрения для измерения, посмотрев на файл журнала (“Chromagnon.log”; см. протокол шаг 3.10). К счастью, эту проблему можно легко преодолеть, усредняя несколько изображений биологической калибровки или используя локальное выравнивание для перекрестных или ярких изображений ссылки (Таблица 2). В отличие от неспособности исправить справочные изображения, неспособность исправить целевые изображения труднее определить. Поскольку такие сбои возникают из-за различий в форматах файлов, условиях визуализации, сроках визуализации, методах визуализации/выравнивания между эталонными и целевыми изображениями(Таблица 2),пользователи должны всегда быть осторожными при использовании эталонных изображений, полученных в различных условиях/таймингах от целевых изображений. Некоторые примеры изображения доступны для тестирования(https://github.com/macronucleus/Chromagnon), чтобы получить конкретное представление о хороших и плохих изображений примера.
Проблема | Вызвать | Решение |
Не удалось исправить эталонное изображение | Низкий контраст | По возможности приобретите более высокое контрастное изображение. При использовании эталонного изображения яркого поля, повторное использование изображения в водном растворе для получения более высокого контраста ячейки. Кроме того, попробуйте применить вычислительное снижение шума (например, гауссианская фильтрация). Выключите локальное выравнивание, которое более чувствительно к шуму. |
Загрязнение несвязанных изображений | Удалите источник не связанных изображений в образце, если это возможно. Для перекрестных эталонных изображений проверьте спектры возбуждения красителей, используемых для целевых изображений. Если красители взволнованы во время приобретения изображения crosstalk (например, Alexa Fluor 568 или 594), рассмотрим другие красители (например, Alexa Fluor 555). Если пыль на чипе камеры создает очевидную разницу в канале, очистите чип камеры или используйте вычислительный метод плоского поля. | |
Чрезвычайно яркое пятно, сделанное космическим лучом | Приобретите изображение снова, если это возможно. Кроме того, попробуйте применить вычислительное снижение шума (например, медианная или гауссиальная фильтрация). | |
Артефакты деконволюции (искусственные сигналы на осевом и боковом краях) | Обрезать пиксели края или разделы после деконволюции. Если одна сторона обрезана, другая сторона также должна быть обрезана для поддержания центра изображения. | |
Размер шага слишком разреженный | Для выполнения критерия Nyquist, написанного в протоколе 2.1.3, должен быть приобретен стек q. | |
Оптическая аберрация | Сферическая аберрация является основной аберрации, вызванной пользователями. Выберите правильный объектив для образца и используйте толщину крышки 170 мкм. Если объектив оснащен кольцом коррекции, отрегулируйте его, чтобы найти положение, в котором наибольшее количество флуоресценции получено из фокуса. В случае масляного погружения цели без коррекции кольца, отрегулируйте рефракционный индекс масла погружения, что увеличивает количество флуоресценции в фокусе. | |
Поле зрения незаполнее (рис. 7) | В случае биологической калибровки справочные изображения, в среднем много изображений. В случае перекрестного разговора или ярко-полевых эталонных изображений используйте локальное выравнивание. | |
Неопознанная ошибка программного обеспечения | Сообщите о проблеме через GitHub(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues) | |
Не удалось исправить целевое изображение | Метаданные файла изображения потеряны | Используйте исходный формат файла микроскопа, содержащий полные метаданные, и избегайте преобразования в многостраничный файл tiff перед обработкой. Используйте тот же заказ каналов, что и в протоколе 3.3. |
Неправильные методы выравнивания для данной микроскопии | Не применять локальный метод выравнивания при измерении от биологической калибровки эталонных изображений к целевым изображениям. Не используйте перекрестные справочные изображения, кроме широкоугольной микроскопии. | |
Различия в условиях визуализации | Поддерживайте постоянную работу между ссылкой и целевыми изображениями, как написано в протоколе 2.3.3. | |
Различия в выборке (включая обложку) | Всегда используйте ту же среду крепления, крышку (например, No 1.5H) и аналогичную глубину фокусировки. | |
Микроскоп дрейф с момента калибровки в последний раз сделал | Сделать калибровку так же часто, как каждые две недели. Держите температуру постоянной, и использовать плавающий стол, чтобы избежать аппаратного дрейфа микроскопа. |
Таблица 2: Устранение неполадок для хроматической коррекции.
Рисунок 7: Примеры эталонных изображений. Ядерный конверт в дрожжевых клетках деления, помеченных GFP и mCherry. Изображения были приобретены с помощью обычной широкополой микроскопии. Хроматические сдвиги были исправлены с помощью Chromagnon без локального выравнивания, используя сами изображения в качестве эталонных изображений. Изображения были затем deconvolved, чтобы показать детали. (A) Хороший пример со многими объектами в поле зрения. (B)Плохой пример с объектами только в верхнем левом углу. Несоответствие очевидно в определенном регионе изображения. (C) Нежелательный пример, когда один из четырех ризек (разделенных пунктирными линиями) пуст. Масштабная планка в панели А указывает 5 мкм для полного представления поля и 1,25 мкм для увеличенного представления и применима ко всем панелям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
В этом протоколе мы описали три различных типа ссылок (Таблица 1). Среди них, перекрестные справочные изображения и биологические калибровочные справочные изображения нуждаются в дальнейшем тщательном обсуждении. Для перекрестных эталонных изображений образцы, окрашенные DAPI или Hoechst 33342, и установленные в глицероле или коммерческих монтажных носителях, могут быть эффективно использованы для выравнивания синих, зеленых и красных каналов. Аналогичным образом, Alexa Fluor 488 может быть использован для выравнивания зеленых и красных каналов. Тем не менее, получение перекрестного флуоресценции часто трудно, поскольку многие синие красители, за исключением DAPI и Hoechst тусклым и распадаются быстрее, чем большинство зеленых и красных красителей. Кроме того, спектры выбросов современных красителей более узки, что делает выравнивание более чем трех каналов этим методом сложным. Следует также обратить внимание на некоторые общие красные красители (например, Alexa Flour 568 и 594, но не Alexa Fluor 555), которые могут быть возбуждены фиолетовый свет, которые предотвращают получение высокой контрастной перекрестного изображения от синих красителей. Другим недостатком является то, что этот метод не может измерить хроматическое аберрация возбудителей световых путей в многоцветном возбуждении, потому что только одна длина волны возбуждения используется для возбуждения (Таблица 1). Поскольку самая передовая микроскопия использует измененную оптику освещения, применение этого метода ограничено. Тем не менее, его более высокая точность коррекции достаточно выгодна для того, чтобы быть описанным в этом протоколе. Как правило, изображение перекрестного разговора должно быть принято после целевого изображения для предотвращения отбеливания или фототоксичных эффектов. Для SMLM наблюдается с широкополым режимом, эталонное изображение должно быть приобретено, прежде чем приобретать целевое изображение, как флуоресценции красители могут быть отбелены во время визуализации.
Биологические калибровочные справочные изображения позволяют пользователям легко выравнивать любое желаемое количество каналов за счет дополнительной подготовки образца. Еще одним преимуществом биологических калибровочных справочных изображений является наличие “усреднения” нескольких ссылок, которые помогают заполнить все поля зрения. Этот метод может страдать от различий в условиях визуализации, если образец калибровки подготовлен на другом слайде. Большая часть этой проблемы может быть решена, если как цели, так и ссылки готовятся на одном слайде с помощью коммерческих камерных крышки(Таблица 1),а другие условия визуализации остаются неизменными, как в протоколе шаг 2.3.3. В этом случае можноожидатьточность коррекции, аналогичную точности перекрестных ссылок. Протокол для использования фаллоидин, как показано здесь является одним из самых простых способов окрашивания одной клеточной структуры с несколькими цветами. Существует множество возможных сценариев подготовки образцов биологической калибровки. Для иммуносеивления, образец может быть помечен одним первичным антителом с последующим окрашивание с вторичными антителами нескольких цветов. Таким образом, единая целевая структура может быть помечена несколькими цветами. Кроме того, 5-этинилл-2′-дезоксюиринин, обнаруженный “нажмите” химии этикетки вновь синтезированных ДНК в нескольких цветах при высокой плотности, как описано подробно ранее8. Для живых клеток полезно подготовить трансгенный штамм, укрывающий две копии гена, которые сливаются с GFP или mCherry, чтобы обозначить одну и ту же структуру двумя цветами. Если число копий гена имеет решающее значение, как часто наблюдается для мембранных белков, одна копия гена может быть тандемно слиты gFP и mCherry (Рисунок 7). Фотоконвертируемые флуоресцентные белки, такие как mEOS218, также могут быть использованы при освещении умеренного уровня фиолетового света для получения обоих видов белка с или без фотоконверсии. При условиях низкого уровня кислорода, GFP также может быть использован в качестве фотоопровержимого белка от зеленого до красного19,,20. Таким образом, выбор правильного образца калибровки сделает эксперимент более надежным.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано JSPS KAKENHI Грант номера JP19H03202 до A.M., JP18H05528 и JP17H03636 до T.H., и JP17H01444 и JP18H05533 до H.Y. L.S. признают поддержку Добро пожаловать Целевой Стратегические награды 091911 и 107457 / / 15 / » финансирование передовых изображений в Micron Оксфорд.
16% formaldehyde solution | Polyscience | 18814-10 | |
35 mm glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
Alexa Fluor 405 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A30104 | |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Alexa Fluor 594 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16170078 | |
Coverslip | Matsunami | No. 1S HT | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate | Nacalai Tesque | 08458-16 | |
Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1000 | |
Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1) | Described in Ref 15. | ||
Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well) | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1) | A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased. | ||
Secondary antibody with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | |
Secondary antibody with Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21424 | |
Secondary antibody with Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
TetraSpeck Microspheres, 0.2 µm | Thermo Fisher Scientific | T7280 |