结合条件敲击和适应球形成测定研究患者衍生胃癌干细胞的干细胞相关基因
Summary
在该协议中，我们提出了一个实验设计，使用条件敲制系统和适应球形分析，以研究聚类对患者衍生GCSC的茎的影响。该协议可以很容易地适应研究在不同类型的CSC的茎相关基因的体外和体内功能。
Abstract
癌症干细胞（CSCs）与肿瘤的启动、发育和治疗后复发有关，近几十年来已成为许多研究关注的焦点。因此，开发研究癌症细胞干细胞中关键基因作用的方法非常重要。胃癌 （GC） 是最常见的和最致命的癌症类型之一。胃癌干细胞（GCSCs）被认为是胃癌复发、转移和耐药性的根源。了解GCSC生物学是需要推动靶向疗法的发展，并最终降低患者的死亡率。在该协议中，我们提出了一个实验设计，使用条件敲制系统和适应球形分析，以研究聚类对患者衍生GCSC的茎的影响。该协议可以很容易地适应研究在不同类型的CSC的茎相关基因的体外和体内功能。
Introduction
胃癌（GC）是最常见的和最致命的癌症类型之一1。尽管在GC治疗中联合手术、化疗和放疗方面取得了进步，但预后仍然很差，五年生存率仍然很低。复发和转移是导致治疗后死亡的主要原因。
癌症干细胞（CSCs）是癌细胞的子集，具有自我更新和生成重建肿瘤3的不同细胞系系的能力。CSC被认为是癌症复发和转移的原因，因为它们具有自我更新和播种新肿瘤的能力，以及他们对传统化疗和放射性治疗的抵抗力。因此，针对CCS和消除CSC提供了改善癌症患者治疗和降低死亡率的令人兴奋的潜力。
CSC已被从多种类型的实体肿瘤中分离出5。2009年，从人类胃癌细胞系分离出的胃癌干细胞（GCSC）最初由Takaishi等人描述。陈和同事首先从人类胃腺癌（GAC）肿瘤组织7中鉴定并纯化了GCSC。这些发现不仅为研究GCSC生物学提供了机会，而且提供了重要的临床意义。
CSC的一个特别特点是它们形成球体8的能力。单细胞在低密度的非固性条件下被镀，只有具有自更新的细胞才能成长为一个称为球体的固体球形聚类。因此，球体形成测定被认为是金本位测定，并广泛用于评估干细胞体外自我更新潜力。
RNA干扰（RNAi）是研究基因功能的一种强有力的研究工具，通过敲击一个特定的基因9。然而，长期稳定的基因敲解技术有一定的局限性，如探索对细胞生存至关重要的基因的功能的挑战。有条件的RNAi系统可用于通过诱导剂的管理，以时间和/或特殊控制的方式降低所需基因的调节。四环素（Tet）可应用系统是使用最广泛的条件RNAi系统10之一。Tet诱导系统可以通过在添加外源诱导剂（优待多氧环素，Dox）时控制shRNA的表达来诱导目标基因沉默。Tet-致失系统可分为两种类型：Tet-On 或 Tet-Off 系统。shRNA的表达可以在诱导器存在的情况下打开（Tet-On）或关闭（Tet-Off）。在没有诱导剂的 Tet-ON 系统中，构成表达的 Tet 抑制器 （TetR） 绑定到包含 Tet 响应 Pol III 依赖启动子的 Tet 响应元素 （TRE） 序列，从而抑制 shRNA 的表达。而加入 Dox 后，TetR 与 Tet 响应 Pol III 依赖的启动器隔离开来。这有利于 shRNA 的表达，并导致基因敲击。
这里描述的协议采用功能性四环素-可吸收的shRNA系统和一个适应球形形成测定来研究星团在患者衍生的GCSC中的功能。我们使用所述协议来研究在GCSC自续订中聚类的影响。这种方法也适用于其他类型的癌症干细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
GC 是全球癌症相关死亡的第三大原因。GCSC对胃癌复发、转移和耐药性至关重要。使用胃癌患者的GCSC将使我们能够探索他们的弱点，并开发治疗GC患者的靶向药物。
球体形成测定是研究癌症干细胞体外自我更新潜力的有用方法。结果可以呈现为形成的球体百分比除以种子的单个细胞的原始数量。我们采用原始方法计算多个时间点的所有细胞/球体的均值大小，以改善这种测定的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了广东省自然科学基金会（2018A030310586） 的支持。 2020A1515010989），广东省医学科学研究基金会（A2019405），国家自然科学基金（81772957），科学 （2017B030301016）及深圳市工业及信息技术基金会（20180309100135860）。
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
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