Combinazione di dispositivi fluidici con microscopia e citometria di flusso per studiare il trasporto microbico nei mezzi porosi attraverso le scale spaziali
Summary
Le curve di svolta (BTC) sono strumenti efficienti per studiare il trasporto di batteri nei mezzi porosi. Qui introduciamo strumenti basati su dispositivi fluidici in combinazione con microscopia e conteggio citometrico del flusso per ottenere I BTC.
Abstract
Comprendere il trasporto, la dispersione e la deposizione di microrganismi nei mezzi porosi è un compito scientifico complesso che comprende argomenti diversi come l’idrodinamica, l’ecologia e l’ingegneria ambientale. La modellazione del trasporto batterico in ambienti porosi su diverse scale spaziali è fondamentale per prevedere meglio le conseguenze del trasporto batterico, ma i modelli attuali spesso non riescono a scalare da laboratorio a condizioni sul campo. Qui introduciamo strumenti sperimentali per studiare il trasporto batterico in mezzi porosi su due scale spaziali. Lo scopo di questi strumenti è quello di ottenere osservabili macroscopici (come curve rivoluzionarie o profili di deposizione) di batteri iniettati in matrici porose trasparenti. Su piccola scala (10-1000 μm), i dispositivi microfluidici sono combinati con la video-microscopia ottica e l’elaborazione delle immagini per ottenere curve rivoluzionarie e, allo stesso tempo, per tracciare singole cellule batteriche alla scala dei pori. Su scala più ampia, la citometria a flusso è combinata con un distributore robotico autoprofeso per ottenere curve rivoluzionarie. Illustriamo l’utilità di questi strumenti per capire meglio come i batteri vengono trasportati in complessi mezzi porosi come la zona iporeica dei corsi d’acqua. Poiché questi strumenti forniscono misurazioni simultanee su scale, aprono la strada a modelli basati su meccanismo, di fondamentale importanza per l’upscaling. L’applicazione di questi strumenti può non solo contribuire allo sviluppo di nuove applicazioni di biorimediazione, ma anche gettare nuova luce sulle strategie ecologiche dei microrganismi che colonizzano substrati porosi.
Introduction
Gli studi volti a comprendere il trasporto di microbi attraverso mezzi porosi sono stati principalmente guidati dapreoccupazioni di contaminazione 1,trasmissione dellamalattia 2 e biorimediazione3. A questo proposito, i batteri sono stati per lo più trattati come particelle neimodelli di trasporto 4 e processi come filtrazione, deformazione, sedimentazione gravitazionale o rimobilitazione da biofilm sono stati identificati come fattori di ritenzione o trasporto di microbi5. Tuttavia, studiare il trasporto di batteri attraverso paesaggi porosi può anche informarci sulle strategie ecologiche alla base del loro successo in questi ambienti complessi. Tuttavia, ciò richiede nuovi esperimenti e modelli matematici che operano a livello di singola cellula, popolazione o comunità microbica.
Gli ambienti porosi naturali, come quelli che si trovano nella zona iporeica di torrenti e fiumi, sono densamente colonizzati da diverse comunità di microbi biofilm-forming6. I biofilm formano strutture che modificano il flusso e quindi il trasporto e la dispersione dei batteri nella faseliquida 7,,8. Il trasporto di batteri su scala porosa dipende dalla limitata disponibilità di spazio nella matrice porosa e la dispersione legata alla motilità può essere un modo efficace per aumentare l’idoneità individuale attraverso una ridotta competizione per le risorse nelle aree meno densamente popolate. D’altra parte, i batteri motili possono anche raggiungere regioni più isolate della matrice porosa e l’esplorazione estesa di tali aree può fornire opportunità ecologiche alle popolazioni mobile10. Su scale spaziali più grandi, la crescita del biofilm devia i percorsi di flusso portando anche all’intasamento (parziale) dei pori e, quindi, alla creazione di condizioni di flusso ancora più canalizzate ed eterogenee11. Ciò ha conseguenze per l’approvvigionamento di nutrienti e la capacità di dispersione, la frequenza e la distanza. Il flusso preferenziale, ad esempio, può generare le cosiddette “corsie preferenziali” e i batteri motili possono raggiungere velocità ancora più elevate rispetto al flusso localelungo questi binari 12. Questo è un modo efficace per aumentare l’esplorazione di nuovi habitat.
Una varietà di strumenti si avvale dello studio del trasporto di batteri (e particelle) mobile e non mobile in mezzi porosi. I modelli numerici hanno grandi capacità predittive importanti per le applicazioni, tuttavia sono spesso limitati da ipotesi intrinseche4. Gli esperimenti su scaladi laboratorio 13,,14 combinati con la modellazione della curva di svolta (BTC) hanno fornito importanti spunti sull’importanza delle proprietà della superficie cellulare batterica per l’efficienza dell’incollaggio15. Tipicamente, i BTC (cioè, serie volte serie di concentrazione di particelle in un luogo fisso) sono ottenuti attraverso rilasci a velocità costante e misurazione del numero di cellule al deflusso del dispositivo sperimentale. In questo contesto, i BTC riflettono la dinamica di advezione-dispersione dei batteri nella matrice porosa e possono essere estesi da un termine di affondamento che rappresenta l’attaccamento. Tuttavia, la modellazione dei BTC da sola non risolve il ruolo dell’organizzazione spaziale del substrato poroso o del biofilm per i processi di trasporto. Altri osservabili macroscopici come la dispersività o i profili di deposizione hanno dimostrato di fornire informazioni importanti sulla distribuzione spaziale o sulle particelle trattenute o sulle comunità in crescita. La microfluidica è una tecnologia che consente di studiare il trasporto in mezzi porosi mediante indagine di microscopia9,12,16, e ad eccezione di un recente lavoro10, i sistemi sperimentali sono tipicamente vincolati a una singola scala di lunghezza di risoluzione, cioè la scala dei pori o l’intera scala del dispositivo fluido.
Qui, introduciamo una suite di metodi combinati per studiare il trasporto di batteri motili e non motili in paesaggi porosi su diverse scale. Combiniamo le osservazioni del trasporto batterico su scala dei pori con informazioni su larga scala, attraverso l’analisi BTC. I dispositivi microfluidici costruiti con litografia morbida utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) sono bio-compatibili, resistenti a una vasta gamma di sostanze chimiche, consentono la replicabilità a bassi costi e forniscono un’eccellente trasparenza ottica e una bassa autofluorescenza critica per l’osservazione microscopica. La microfluidica a base di PDMS è stata precedentemente utilizzata per studiare il trasporto di microbi incanali semplici 17 o in geometrie più complesse12. Tuttavia, tipicamente gli esperimenti di microfluidica si concentrano su orizzonti a breve termine e l’osservazione microscopica dell’epi-fluorescenza delle cellule viventi è comunemente limitata a ceppi geneticamente modificati (ad esempio, ceppi taggati dalla GFP). Qui presentiamo strumenti per studiare il trasporto batterico utilizzando dispositivi microfluidici basati su PDMS in combinazione con microscopia e dispositivi più grandi fabbricati da poli (metacrilato metile) (PMMA, noto anche come plexiglass) in combinazione con citometria a flusso. PDMS e PMMA differiscono per permeabilità al gas e proprietà superficiali, offrendo così opportunità complementari per studiare il trasporto batterico. Mentre il dispositivo microfluidico fornisce un ambiente più controllato, il dispositivo più grande consente esperimenti per lunghi periodi di tempo o utilizzando comunità batteriche naturali. Il conteggio delle microscopie ad alta risoluzione temporale in un’area dedicata viene utilizzato per ottenere BTC nel dispositivo microfluidico basato su PDMS. Per ottenere il conteggio delle celle per la modellazione BTC dal dispositivo basato su PMMA, introduciamo un distributore automatico di liquidi autocostruito in combinazione con la citometria a flusso. In questa configurazione, le cellule passano il dispositivo fluido e vengono erogate consecutivamente in 96 piastre di pozzo. La risoluzione temporale è limitata dal volume minimo che può essere accuratamente eroso e quindi dalla portata media attraverso il dispositivo fluido. Il fissatore nei pozzi previene la crescita e facilita la colorazione del DNA per l’enumerazione citometrica a flusso a valle. Per prevenire la crescita batterica durante gli esperimenti di trasporto utilizziamo un mezzo minimo (termo buffer di motilità).
Poiché i protocolli per la preparazione di dispositivi fluidici su scale diverse sono prontamente disponibili, introduciamo solo brevemente le tecniche per produrre tali dispositivi e ci concentriamo piuttosto sulle procedure sperimentali per registrare i BTC. Allo stesso modo, esistono varie routine per l’enumerazione citometrica del flusso dei microbi e gli utenti richiedono conoscenze esperte per interpretare i risultati ottenuti dalla citometria del flusso. Reportiamo il nuovo uso di dispositivi microfluidici in combinazione con l’imaging microscopico per registrare I BTC di cellule con tag fluorescenti. Alla scala dei pori, le velocità e le traiettorie locali si ottengono attraverso l’elaborazione delle immagini. Inoltre, dimostriamo l’uso di un dispositivo fluido a base di PMMA in combinazione con il conteggio flusso-citometrico per osservare il trasporto batterico di cellule mobili e non mobili in ambienti porosi colonizzati da un biofilm a flusso nativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui suggeriamo due mezzi per studiare il trasporto di microbi attraverso sistemi porosi a livello di singola cellula e popolazione. Mentre lo studio dei fenomeni di trasporto mediante modellazione BTC ha fornito preziose informazioni sulla diffusione di agenti patogeni o contaminanti su scala ecosistemica, esistono ancora difficoltà da scalare dagli esperimenti di laboratorio alle condizioni sul campo. Gli strumenti qui descritti consentono ai ricercatori di risolvere sperimentalmente le scale spaziali e temporali al fi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo l’aiuto di Antoine Wiedmer con l’installazione del distributore robotico e la dispenser.py script.
Materials
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
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