Summary

İntravital Mikroskopi ile Zebrabalığı Embriyolarında Mikobakteriyel Enfeksiyon Sırasında Makrofaj Litik Hücre Ölümünün Görüntülenmesi

Published: January 09, 2019
doi:

Summary

Bu protokol, Mycobacterium marinum enfeksiyonu sırasında embriyonik zebra balığında makrofaj davranışını ve ölümü görselleştirmek için bir tekniği açıklamaktadır. Bakterilerin hazırlanması, embriyoların enfeksiyonu ve intravital mikroskopi için adımlar dahildir. Bu teknik, enfeksiyon veya steril inflamasyon içeren benzer senaryolarda hücresel davranış ve ölüm gözlem uygulanabilir.

Abstract

Zebrabalığı, şeffaf doğası ve erken gelişim sırasında sadece doğuştan gelen bağışıklık sistemine güvenilmesi nedeniyle doğuştan gelen bağışıklık hücresi davranışını incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum)enfeksiyon modeli mikobakteriyel enfeksiyona karşı konak bağışıklık yanıtı çalışmada iyi kurulmuştur. Farklı makrofaj hücre ölüm türlerinin mikobakteriyel enfeksiyonun çeşitli sonuçlarına yol açacağı ileri sürülmüştür. Burada M. marinum enfeksiyonu sonrası zebra balığı embriyolarında makrofaj hücre ölümünü gözlemlemek için intravital mikroskopi kullanılarak yapılan bir protokolü açıklıyoruz. Özellikle makrofajlar ve nötrofiller etiket zebra balığı transgenik çizgiler orta beyin veya gövde de floresan M. marinum etiketli intramüsküler mikroenjeksiyon yoluyla enfekte. Enfekte zebra balığı embriyoları daha sonra düşük eriyen agarose üzerine monte edilir ve X-Y-Z-T boyutlarında konfokal mikroskopi ile gözlenir. Uzun süreli canlı görüntüleme fotobeyazrlama ve fototoksisite önlemek için düşük lazer gücü kullanarak gerektirir çünkü, güçlü bir transgenik ifade şiddetle tavsiye edilir. Bu protokol, immün hücre göçü, konak patojen etkileşimi ve hücre ölümü de dahil olmak üzere in vivo dinamik süreçlerin görselleştirilmesini kolaylaştırır.

Introduction

Mikobakteriyel enfeksiyon konak bağışıklık hücresi ölümüne neden olduğu gösterilmiştir1. Örneğin, zayıflatılmış bir suş makrofajlarda apoptosis tetikler ve enfeksiyon içerir. Ancak, öldürücü bir suş litik hücre ölümü tetikleyecek, bakteriyel yayılmasına neden1,2. Bu farklı hücre ölümü türlerinin konak anti-mikobakteriyel yanıt üzerindeki etkisi göz önüne alındığında, in vivo mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj hücre ölümünün ayrıntılı bir gözlemine ihtiyaç vardır.

Hücre ölümünü ölçmek için geleneksel yöntemler ölü hücre lekeleri kullanmak için, Annnexin V gibi, TUNEL, veya acridine turuncu / propidium iyodür boyama3,4,5. Ancak, bu yöntemler in vivo hücre ölümü dinamik sürecine ışık tutmak mümkün değildir. Hücre ölümünün in vitro gözlemi zaten canlı görüntüleme6ile kolaylaştırılmıştır. Ancak, sonuçların fizyolojik koşulları doğru bir şekilde taklit edip etmediği belirsizliğini koruyor.

Zebra balığı konak anti-micobacterium yanıtları incelemek için mükemmel bir model olmuştur. Bu insanların benzer bir son derece korunmuş bağışıklık sistemi vardır, kolayca manipüle genom, ve erken embriyolar şeffaf, hangi canlı görüntüleme sağlar7,8,9. M. marinum enfeksiyonu ndan sonra, yetişkin zebra balıkları tipik olgun granülom yapıları oluşturur, ve embriyonik zebrabalık yapıları gibi erken granülom formu9,10. Doğuştan gelen bağışıklık hücre-bakteri etkileşiminin dinamik süreci daha önce zebra balığı M. marinum enfeksiyonu modeli11,12araştırılmıştır. Ancak, yüksek mekansal-zamansal çözünürlük gereksinimi nedeniyle, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin ölümü çevreleyen ayrıntılar büyük ölçüde tanımsız kalır.

Burada in vivo mikobakteriyel enfeksiyonun tetiklediği makrofaj litik hücre ölümü sürecini nasıl görselleştirebileceğimizi anlatıyoruz. Bu protokol aynı zamanda geliştirme ve inflamasyon sırasında in vivo hücresel davranışı görselleştirmek için de uygulanabilir.

Protocol

Zebra balıkları, hayvan refahının etik olarak gözden geçirilmesi için laboratuvar hayvanı yönergelerine uygun olarak standart koşullar altında yetiştirilmiştir (GB/T 35823-2018). Bu çalışmadaki tüm zebra balığı deneyleri onaylandı (2019-A016-01) ve Fudan Üniversitesi Şangay Halk Sağlığı Klinik Merkezi’nde gerçekleştirildi. 1. M. marinum Tek Hücreli Inokül Hazırlama (Şekil 1) -80 °C’den gelen eritme Cerulean-flor…

Representative Results

Mycobacterium enfeksiyonu enfeksiyon yollarına göre farklı konak yanıtları tetikleyebilir. Bu protokolde zebra balığı embriyoları orta beyne veya gövdeye floresan etiketli bakterilerin intramüsküler mikroenjeksiyonuileenfekte olmuş ve konfokal canlı görüntüleme ile gözlenmiştir. Bu iki yol üzerinden enfeksiyon yerel doğuştan gelen bağışıklık hücresi işe ve sonraki hücre ölümüne neden enfeksiyon kısıtlar. Doğuştan gelen bağış…

Discussion

Bu protokol, mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj ölüm görselleştirme açıklar. Hücre zarının bütünlüğü gibi faktörlere bağlı olarak, enfeksiyon apoptosis ve litik hücre ölümü24,25ayrılabilir. Litik hücre ölümü apoptoz daha organizma için daha stresli, güçlü bir inflamatuar yanıt tetikler çünkü 24,25. Yüksek mekansal-temporal çözünürlük, uygun konfokal mikr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz zebra balığı suşları paylaşımı için Dr Zilong Wen teşekkür, Dr Stefan Oehlers ve Dr David Tobin M. marinum ilgili kaynakları paylaşmak için, Yuepeng He şekil hazırlanmasında yardım için. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81801977) (B.Y.), Şangay Belediye Sağlık Komisyonu Üstün Gençlik Eğitim Programı (2018YQ54) (B.Y.), Şangay Yelken Programı (18YF1420400) (B.Y.) ve Şangay Verem Anahtar Laboratuvarı Açık Fonu (2018KF02) (B.Y.Y.) tarafından desteklenmiştir.

Materials

0.05% Tween-80 Sigma P1379
10 mL syringe Solarbio YA0552
10% OADC BD 211886
3-aminobenzoic acid Sigma E10521
5 μm filter Mille X SLSV025LS
50 μl/ml hygromycin Sangon Biotech A600230
7H10 BD 262710
7H9 BD 262310
A glass bottom 35 mm dish In Vitro Scientific D35-10-0-N
Agarose Sangon Biotech A60015
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Enviromental Chamber Pecon temp control 37-2 digital
Eppendorf microloader Eppendorf No.5242956003
Glass microscope slide Bioland Scientific LLC 7105P
Glycerol Sangon Biotech A100854
Incubator Keelrein PH-140(A)
M.marinum ATCC BAA-535
Microinjection needle World Precision Instruments IB100F-4
Microinjector Eppendorf Femtojet
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
msp12:cerulean Ref.: PMID 25470057; 27760340
Phenol red Sigma P3532
PTU Sigma P7629
Single concavity glass microscope slide Sail Brand 7103
Sonicator SCICNTZ JY92-IIDN
Spectrophotometer (OD600) Eppendorf AG 22331 Hamburg
Stereo Microscope OLYMPUS SZX10
Tg(mfap4:eGFP) Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) Ref.: PMID 27424497; 17477879

References

  1. Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
  2. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
  3. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
  4. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
  5. Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
  6. Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
  7. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
  8. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  9. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  10. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
  11. Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  14. Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
  15. Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
  16. Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
  17. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  18. Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
  19. Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
  20. Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
  21. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
  22. Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
  23. Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
  24. Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
  25. Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker’s guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).

Play Video

Cite This Article
Niu, L., Wang, C., Zhang, K., Kang, M., Liang, R., Zhang, X., Yan, B. Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e60698, doi:10.3791/60698 (2019).

View Video