Summary

Évaluation de la guérison aigue des plaies à l’aide de l’implantation d’éponge d’alcool polyvinyl subcutanée et des modèles excisionaux de blessure de peau de queue.

Published: March 25, 2020
doi:

Summary

Ici, deux modèles murins de guérison de blessure sont décrits, l’un conçu pour évaluer les réponses cellulaires et de guérison de blessure de cytokine et l’autre pour quantifier le taux de fermeture de blessure. Ces méthodes peuvent être utilisées avec des modèles complexes de maladies telles que le diabète pour déterminer les mécanismes de divers aspects de la mauvaise cicatrisation des plaies.

Abstract

La cicatrisation des plaies est un processus complexe qui exige la progression ordonnée de l’inflammation, la formation des tissus de granulation, la fibrose et la résolution. Les modèles murins fournissent un aperçu mécaniste précieux de ces processus; cependant, aucun modèle unique ne traite entièrement de tous les aspects de la réponse de guérison des plaies. Au lieu de cela, il est idéal d’utiliser plusieurs modèles pour aborder les différents aspects de la cicatrisation des plaies. Ici, deux méthodes différentes qui traitent de divers aspects de la réponse de guérison de blessure sont décrites. Dans le premier modèle, les éponges d’alcool polyvinyles sont sous-cutanées implantées le long du dorsum de souris. Après la récupération de l’éponge, les cellules peuvent être isolées par perturbation mécanique, et les fluides peuvent être extraits par centrifugation, permettant ainsi une caractérisation détaillée des réponses cellulaires et cytokine dans l’environnement aigu de blessure. Une limitation de ce modèle est l’incapacité d’évaluer le taux de fermeture des plaies. Pour cela, un modèle d’excision de la peau de la queue est utilisé. Dans ce modèle, un morceau rectangulaire de 10 mm x 3 mm de la peau de la queue est excisé le long de la surface dorsale, près de la base de la queue. Ce modèle peut être facilement photographié pour l’analyse planimétrique pour déterminer les taux de guérison et peut être excisé pour l’analyse histologique. Les deux méthodes décrites peuvent être utilisées dans les souches de souris génétiquement altérées, ou en conjonction avec des modèles de conditions comorbides, telles que le diabète, le vieillissement, ou l’infection secondaire, afin d’élucider les mécanismes de cicatrisation des plaies.

Introduction

Il existe de nombreux systèmes de modèles murins disponibles pour examiner les processus de cicatrisation des plaies, chacun possédant des avantages spécifiques et des limitations1,2. Les méthodes suivantes présentent deux modèles de plaies murines, chacun abordant un aspect particulier de la réponse de guérison de blessure, et qui peuvent être employés pour identifier la cause et l’effet des perturbations dans la réponse aux dommages. Le processus de cicatrisation des plaies se produit dans des phases distinctes. La première phase est inflammatoire, caractérisée par l’afflux rapide de plaquettes, de neutrophiles et de monocytes/macrophages, ainsi que par la production de cytokines et de chimiocontres proinflammatoires. Après la résolution de l’inflammation, l’environnement passe à un état plus réparateur avec l’induction des cytokines profibrotiques et proangiogéniques et des facteurs de croissance. Le tissu de granulation est déposé et les néovessels se forment avec la migration des myofibroblastes, des fibroblastes, des cellules épithéliales, et des cellules endothéliales. Dans les phases finales, la matrice extracellulaire provisoire est remodelée, et la formation de cicatrices et la fermeture de blessure procède2,3,4,5,6,7,8.

Aucun modèle murin unique ne fournit un système pour étudier toutes les étapes de la cicatrisation desplaies 2. Ici, deux modèles chirurgicaux de blessure sont décrits : l’un élucide les réponses cellulaires aigues et de guérison de blessure de cytokine, et l’autre permet l’évaluation de la fermeture de blessure aussi bien que des analyses histologiques. Ces deux méthodes peuvent être utilisées de façon complémentaire pour évaluer les effets d’une perturbation ou d’une comorbidité sur différents aspects de la réponse de guérison des plaies. L’implantation sous-cutanée dorsale des éponges d’alcool polyvinyle (PVA) est un système qui a été utilisé dans les modèles de rongeurs pendant des décennies pour élucider de nombreux aspects des réponses cellulaires et de tissu de granulation9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Cette approche permet la récupération de liquides de plaie riches en cytokine et d’infiltrations cellulaires. Dans ce modèle, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm de morceaux d’éponge PVA sont placés dans des poches sous-cutanées par une incision de 2 cm faite à la ligne médiane dorsale postérieure. L’incision est fermée avec des clips chirurgicaux, et les éponges peuvent être récupérées à des points plus tard pour l’isolement cellulaire et fluide. Le milieu cellulaire et cytokine des éponges isolées reflète les étapes normales de la guérison aigue de blessure jusqu’à environ 14 jours postimplantation. À des points de temps ultérieurs le modèle est plus avantageux pour étudier la formation de tissu de granulation et la réponse du corps étranger1. Avec ce système, il est possible d’isoler les cellules de6, ce qui offre un avantage distinct pour les tests phénotypiques et fonctionnels et l’isolement de l’ARN, sur l’isolement des cellules d’autres méthodes à base de biopsie1,22,23,25,26.

Le taux de fermeture de la plaie est déterminé à l’aide du modèle d’excision de la peau de la queue. Dans ce modèle, comme initialement décrit par Falanga et al. et rapporté par d’autres27,28,29,30, une section de 1 cm x 0,3 cm pleine épaisseur de la peau de queue est enlevée près de la base de la queue. La zone de la plaie est facilement visualisée et peut être mesurée au fil du temps. Alternativement, le tissu de queue peut être isolé pour l’analyse histologique. Cette approche peut être utilisée comme alternative ou en conjonction avec la méthode bien établie de biopsie de poinçon dorsale. Les principales distinctions entre ces deux modèles sont le taux de fermeture des plaies, la présence ou l’absence de fourrure, et la structure de la peau2,31,32. Les plaies de peau de queue offrent un délai plus long pour évaluer la fermeture des plaies, car il faut environ 21 jours pour que la fermeture complète se produise. Ceci s’oppose aux biopsies non attelles de poinçon dorsale, qui guérissent beaucoup plus rapidement (7-10 jours), principalement par contraction due à l’action du carnosus panniculus. Les biopsies de poinçon dorsale attelle guérissent plus lentement et diminuent les effets de la guérison contractile, mais comptent sur la présence d’un corps étranger pour restreindre les mécanismescontractuels-basés 1,2,27,30,31,33.

Les modèles décrits de blessure sont informatifs pour comprendre les processus normaux de guérison de blessure en l’absence de perturbation. Tandis que la guérison de la peau de rongeur diffère de manière très significative de la peau humaine, y compris la structure lâche, la dépendance à la guérison contractile, et d’autres différences anatomiques, le système murin offre certains avantages pour des études mécanistes et de criblage. La disponibilité de souches consanguines et de mutants génétiques, la tractabilité génétique et le coût inférieur sont au premier plan. La perspicacité mécaniste acquise à partir d’études murines peut être traduite en modèles animaux complexes qui imitent plus étroitement la guérison de la peau humaine, comme le système porcin2,31.

En plus d’examiner les réponses de guérison de blessure dans l’état régulier, ces modèles peuvent être combinés avec des conditions comorbides pour comprendre la base des défauts de guérison de blessure au niveau cellulaire, de cytokine, et brut de tissu. C’est dans ce cadre particulier que les deux modèles peuvent être utilisés de concert pour évaluer les effets d’une affection comorbide particulière, comme la pneumonie postopératoire, à la fois sur la réponse de guérison des plaies cellulaires aigues et sur le taux de fermeture desplaies 30.

Protocol

Toutes les études sur les animaux décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Brown et menées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux des National Institutes of Health.  REMARQUE : dans la vidéo, le drapé chirurgical a été omis à des fins de démonstration. 1. Implantation sous-cutanée des éponges PVA Utilisez des ciseaux pour couper des feuilles d’éponge PVA en mo…

Representative Results

Réponse inflammatoire systémique après l’implantation d’éponge de PVALa chirurgie d’implantation d’éponge de PVA a généré une réponse inflammatoire systémique, comme démontré par l’induction de l’IL-6 dans le plasma 1 jour après la blessure(figure 2A). D’autres cytokines proinflammatoires, y compris TNF-MD et IL-1, ainsi qu’un tableau de chimiothèques, y compris CCL2 et CXCL1 ont été induits systématiquement dans les 7 premiers jours apr?…

Discussion

Cet article décrit deux modèles de plaies murines tractables qui permettent l’évaluation de la réponse aigue de guérison de blessure. La première méthode implique l’implantation chirurgicale des éponges de PVA dans l’espace sous-cutané dorsal. Cette approche offre un avantage distinct sur les modèles de plaies à base de biopsie pour étudier la réponse de guérison cellulaire de blessure due au grand nombre de cellules et à la quantité de fluides de blessure obtenus des éponges isolées. Pour l’ex?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs souhaitent remercier Kevin Carlson, de l’Installation de cytométrie et de tri des flux de l’Université Brown, pour consultation et aide aux expériences de cytométrie des débits. Des images de la figure 1B et de C ont été créées avec BioRender. Kayla Lee et Gregory Serpa sont remerciés pour leur aide photographique. Ce travail a été soutenu par des subventions de ce qui suit: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean’s Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Training in Environmental Pathology) et Brown University Research Seed Award.

Materials

10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17×100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum – Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge – large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

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Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

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