Hier beschrijven we een eenvoudige en goedkope methode die het mogelijk maakt de kwantificering van lijmtumorcellen naar lymfeklier (LN) cryosecties. LN-aanhangende tumorcellen worden gemakkelijk geïdentificeerd door lichtmicroscopie en bevestigd door een fluorescentiegebaseerde methode, waardoor een adhesie-index wordt gegeven die de tumorcelbindende affiniteit met LN-parenchyma onthult.
Tumordrainerende lymfeklieren (LNs) zijn niet alleen filters van tumorgeproduceerd afval. Ze zijn een van de meest voorkomende regionale locaties van voorlopige verblijfplaats van verspreide tumorcellen bij patiënten met verschillende vormen van kanker. De detectie van deze LN-residing tumorcellen is een belangrijke biomarker geassocieerd met een slechte prognose en adjuvante therapie beslissingen. Recente muismodellen hebben aangegeven dat LN-residing tumorcellen een wezenlijke bron van kwaadaardige cellen voor verre metastasen zouden kunnen zijn. De mogelijkheid om de adhesiviteit van tumorcellen te kwantificeren aan LN parenchyma is een kritische graadmeter in experimenteel onderzoek dat zich richt op de identificatie van genen of signaleringstrajecten die relevant zijn voor lymfe/gemetastaseerde verspreiding. Omdat LN’s complexe 3D-structuren zijn met een verscheidenheid aan verschijningen en samenstellingen in weefselsecties, afhankelijk van het vlak van sectie, zijn hun matrices moeilijk experimenteel in vitro te repliceren op een volledig gecontroleerde manier. Hier beschrijven we een eenvoudige en goedkope methode die het mogelijk maakt de kwantificering van lijmtumorcellen naar LN cryosecties. Met behulp van seriële secties van dezelfde LN passen we de klassieke methode die Brodt ontwikkelde aan om niet-radioactieve labels te gebruiken en direct het aantal vasthoudende tumorcellen per LN-oppervlak te tellen. LN-aanhangende tumorcellen worden gemakkelijk geïdentificeerd door lichtmicroscopie en bevestigd door een fluorescentiegebaseerde methode, waardoor een adhesie-index wordt gegeven die de celbindende affiniteit met LN-parenchyma onthult, wat suggestief bewijs is van moleculaire veranderingen in de affiniteitsbinding van integrinns aan hun correlerende LN-liganden.
Kankermetastase is de belangrijkste reden voor het falen van de behandeling en het dominante levensbedreigende aspect van kanker. Zoals 130 jaar geleden gepostuleerde, de uitgezaaide verspreiding resultaten wanneer een elite van verspreide tumorcellen (DDC’s, de “zaden”) verwerven specifieke biologische vaardigheden die hen in staat stellen om primaire sites te ontwijken en kwaadaardige groei vast te stellen op verre plaatsen (de “bodem”)1. Onlangs zijn verschillende nieuwe concepten met betrekking tot de “zaad en bodem” relaties ontstaan, zoals de inductie van pregemetastaseerde niches (geconceptualiseerd als een “vruchtbare bodem” die nodig is voor “zaden” om te gedijen), zelfzaaiende primaire tumoren door DDC’s, “zaad” rust op secundaire organen en de parallelle progressie model van metastase2.
Voor de meeste solide maligniteiten kunnen DDC’s zich bevinden en worden gedetecteerd in veel mesenchymale organen, zoals beenmerg en lymfeklieren (LNs) bij patiënten met of zonder bewijs van klinische metastase. Omdat tumordrainerende LN’s de eerste locatie zijn van de regionale verspreiding van DDC’s, is de LN-status een belangrijke prognostische indicator en wordt vaak geassocieerd met adjuvante therapiebeslissingen3. Voor sommige tumortypes is de correlatie tussen LN-status en slechtere resultaten sterk, waaronder hoofd en nek4,5, borst6,prostaat7,long8, maag9, colorectale10,11 en schildklierkanker12.
LNs zijn kleine eivormige organen van het lymfestelsel, die zijn bedekt met reticulaire cellen en ingesloten met lymfevaten. Deze organen zijn absoluut noodzakelijk voor de werking van het immuunsysteem13. LNs fungeren als attractant platforms voor immuun circulerende cellen, het samenbrengen van de lymfocyten en antigeen-presenterende cellen14. Echter, LNs trekken ook circulerende tumorcellen. Gedurende tientallen jaren werden LN’s afgebeeld als passieve routes van transport voor uitgezaaide tumorcellen. Recente studies hebben echter aangetoond dat tumorcellen ook naar LN’s kunnen worden geleid door chemotactische (chemokines) en/of haptotactische (extracellulaire matrixelementen) signalen die worden afgescheiden door het lymfeendotheel15. Als voorbeelden vergemakkelijkt overexpressie van de CCR7-receptor in tumorcellen de begeleiding van uitgezaaide melanoomcellen naar tumordrainerende LNs16. Bovendien, extracellulaire LN eiwitten bieden een kleefsteiger voor de werving en overleving van circulerende tumorcellen17. In feite, tumor-drainerende LNs bieden vruchtbare bodem voor het zaaien van DDC’s, die kan worden gehandhaafd in proliferative of slapende staten door specifieke LN microenvironmental signalen18. Het uiteindelijke lot van deze LN-residing DTCs is controversieel; sommige werken suggereren dat deze cellen passieve indicatoren zijn van uitgezaaide progressie19, terwijl anderen voorstellen dat ze waarschijnlijker grondleggers zijn van resistentie (door zelfzaaiende primaire sites) en/of fungeren als cellulaire reservoirs voor metastasen (verspreiding van “zaden” voor tertiaire kankergroei)20,21. Onlangs, met behulp van preklinische modellen, is aangetoond dat een fractie van deze LN-residing DTCs actief binnengevallen bloedvaten, in de bloedcirculatie en gekoloniseerd de longen21.
Gezien het feit dat de aanwezigheid van kankercellen in LN’s is een marker voor kanker agressiviteit en invasieve, in deze studie, hebben we geoptimaliseerd een klassieke methode ontwikkeld door Brodt22 kwantitatief te meten tumorcel hechting aan LN’s in vitro. Het gebruik van een op fluorescentie gebaseerde test stelde ons in staat om een goedkoop, snel, gevoelig en milieuvriendelijk (niet-radioactief) protocol te ontwikkelen voor de detectie van lijmveranderingen tussen tumorcellen en LN-cryosecties. Met behulp van de MCF-7 borstkankercellen die verschillende niveaus van NDRG4-genexpressie en ratten LN-bevroren secties uitdrukken om de methode te illustreren, toonden we aan dat dit protocol een goede correlatie mogelijk maakte tussen tumorcelhechting aan LN’s in vitro en LN metastase waargenomen bij borstkankerpatiënten24.
Lymfatische systeem verspreiding van kankercellen vereist een verscheidenheid van complexe cel-gedreven gebeurtenissen. Ze initiëren met celonthechting van primaire tumor en de remodelleren van de extracellulaire matrix (ECM) architectuur, en worden ondersteund door aanhoudende chemotaxis en actieve migratie via de afferente lymfoïden op weg naar de sentinel LN’s. Als kankercellen zich hechten en overleven in LNs, kunnen ze zich gemakkelijk verspreiden naar andere secundaire organen. Hier beschrijven we een eenvoudige …
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Dr. Rosana De Lima Pagano en Ana Carolina Pinheiro Campos voor technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van: FAPESP – São Paulo Research Foundation (2016/07463-4) en Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
2-propanol | Merck | 109634 | |
Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
Isofluran 100 mL | Cristália | ||
Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
RPMI | Gibco | 31800-022 | |
Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |