Summary

Separação do envelope celular para bactérias gram-negativas em frações de membrana interna e externa com ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

Published: April 10, 2020
doi:

Summary

Bactérias gram-negativas produzem duas membranas espacialmente segregadas. A membrana externa é particionada da membrana interna por um periplasma e uma camada peptidoglicana. A capacidade de isolar as bicamadas duplas desses micróbios tem sido fundamental para a compreensão de sua fisiologia e patogênese.

Abstract

Este método funciona dividindo o envelope de bactérias Gram-negativas em frações totais, internas e externas (OM) e conclui com ensaios para avaliar a pureza das bicamadas. O OM tem uma densidade global aumentada em comparação com a membrana interna, em grande parte devido à presença de lipooligossacarídeos (LOS) e lipopolissacarídeos (LPS) dentro do folheto externo. As moléculas de LOS e LPS são glicrarídeos anfipáticos que possuem uma estrutura semelhante, que consiste em um lipídio-A disaccharolipid e core-oligossacarídeo substitutivo. No entanto, apenas as moléculas de LPS são decoradas com uma terceira subunidade conhecida como O-polissacarídeo, ou O-antígeno. O tipo e a quantidade de glicolipídios presentes afetarão a densidade de OM de um organismo. Portanto, testamos se as membranas de bactérias com conteúdo glicolilílipídico variado poderiam ser isoladas da mesma forma usando nossa técnica. Para os organismos produtores de LPS, Salmonella enterica serovar Typhimurium e Escherichia coli,as membranas foram facilmente isoladas e a moiety de o-antígeno LPS não impactou a particionamento bicamada. Acinetobacter baumannii produz moléculas de LOS, que têm uma massa semelhante às moléculas de LPS deficientes de O-antígeno; no entanto, as membranas desses micróbios não puderam ser inicialmente separadas. Nós raciocinamos que o OM de A. baumannii era menos denso que o de Enterobacteriaceae, de modo que o gradiente de sacarose foi ajustado e as membranas foram isoladas. A técnica pode, portanto, ser adaptada e modificada para uso com outros organismos.

Introduction

As bactérias gram-negativas produzem duas membranas que são separadas por um espaço periplasmático e uma parede celular peptidoglicana1. A membrana interna (IM) envolve o citosol e é um bicamada simétrico de fosfolipídeos. Peptidoglicano protege contra a pressão de turgor e fornece a bactéria com uma forma celular, e é anexado à membrana externa (OM) por lipoproteínas2,3. O OM envolve o periplasma e é predominantemente assimétrico. O folheto interno consiste em fosfolipídios e o folheto externo consiste de glicolipídios conhecidos como lipooligossacarídeos (LOS) ou lipopolissacarídeos (LPS)4,5. A assimetria lipídica e a bioquímica das moléculas de LOS/LPS no folheto externo conferem propriedades de barreira à superfície celular que protegem a bactéria contra perigos em seu ambiente6,7.

As moléculas de LPS são compostas por três constituintes: o lipídio A disaccharolipid, o oligossacarídeo central, e o O-polissacarídeo ou o-antígeno. Lipídico A é um disaccharolipídeo acylado multiplicado. Os oligossacarídeos principais consistem de 10-15 açúcares conhecidos como LPS bruto ou R-LPS. O núcleo é subdividido na região interna, composto por ácido 2-keto-3-desoxi-d-manno-octulosônico (kdo) e um ou mais resíduos de heptose, e uma região externa que consiste geralmente de hexoses (glicose ou galactose) e heptoses, ou açúcares de acetamido5. A região do núcleo externo é mais variável em seus componentes e estrutura do que o núcleo interno. Em Salmonella spp., apenas uma estrutura central foi descrita; no entanto, em Escherichia coli existem cinco estruturas centrais diferentes (designadas K-12, R1, R2, R3 e R4)8. E. coli K-12 DH5α, que usamos neste procedimento, carrega uma mutação que resulta na produção R-LPS9. As moléculas de R-LPS não possuem o moiety de antígeno O e têm um peso molecular semelhante às moléculas de LOS.

A adição de o-antígeno ao R-LPS transforma esta molécula em LPS suave, ou S-LPS. Os antígenos O são construídos a partir de subunidades curtas de 3-4 carboidratos e consistem em múltiplas modalidades com comprimentos de cadeia variados10. Algumas bactérias produtoras de LPS, como Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Tipilásurio), apresentar uma distribuição trimodal de moléculas de LPS em sua superfície10,11. Os antígenos O de cadeia muito longa podem conter mais de cem subunidades e pesar mais de cem kilodaltons. Os antígenos O fornecem propriedades superficiais à bactéria que são necessárias para resistir aos antibióticos, evitar a predação por bacteriófagos e causar doenças.

Espécies de Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria e outras geram moléculas de LOS em vez de moléculas de LPS em sua superfície12. As moléculas de LOS consistem em lipídios A e oligossacarídeos do núcleo, mas não possuem o antígeno O. Estes tipos de bactérias Gram-negativas modificam seus oligossacarídeos centrais com açúcares adicionais e combinações de açúcares para alterar as propriedades superficiais12. Tanto os micróbios produtores de LOS quanto os de LPS derivam os fosfatos em lipídios A e moléculas do núcleo com moieties cationic7. Essas adições incluem substituições de fosfoetanolamina, galactosamina e aminoarabinose, que funcionam neutralizando a carga de superfície aniônica e, assim, protegendo contra peptídeos antimicrobianos catínicos. As bactérias gram-negativas também modificam a estrutura do oligossacarídeo central com substituições variáveis não estequiométricas de açúcares, ou moléculas extras de kdo, e alteram o número de cadeias de acilem nos disaccharolipídioslipídicos 7.

A capacidade de isolar o IM do OM das bactérias Gram-negativas tem sido fundamental para compreender o papel do envelope celular na resistência antimicrobiana e na patogênese da doença11,12. Derivações dessa abordagem têm sido utilizadas para deduzir mecanismos de montagem, manutenção e remodelação dos constituintes proteicos, fosfolipídios e glicolipídicos para o OM.

Nosso laboratório realiza rotineiramente análises lipidomicas bacterianas para estudar a regulação lipídica mediada por proteínas e a função lipídica em uma variedade de espécies Gram-negativas. Os volumes utilizados no protocolo refletem o uso rotineiro deste procedimento para analisar fosfolipídeos não rotulados por cromatografia de camada fina e cromatografia líquida tandem espectrometria de massa13,14.

O protocolo começa expondo uma suspensão refrigerada de bactérias Gram-negativas a uma solução osmolar alta de sacarose e adicionando lysozyme para dissociar o OM da camada peptidoglicana subjacente(Figura 1)12. O EDTA é então adicionado para facilitar a penetração do lisozime, uma vez que o sequestro de cátion divalente interrompe as interações de ponte eletrostática lateral entre moléculas de LOS/LPS adjacentes15. O protocolo original do qual o nosso foi adaptado exigiu a formação de esheroplastos, uma forma de célula bacteriana Gram-negativa que consiste em uma membrana plasmática e citosol, mas não possui a camada peptidoglicana e um OM. É possível que os esheroplastos sejam produzidos pelo método adaptado; no entanto, a técnica não confia ou pretende sua formação para o sucesso. Em vez disso, as bactérias tratadas com lysozyme-EDTA são rapidamente colhidas pela centrifugação e re-suspensas em uma solução de sacarose de menor concentração antes da lse pressurizada. Os OMs que poderiam ter sido liberados formando esferoplastos devem, em teoria, ser colhidos dos sobrenatantes das células tratadas, mas esta abordagem não é detalhada aqui. Em última análise, as células tratadas são submetidas à homogeneização e lice convencional, o que aumenta a eficiência e a reprodutibilidade do procedimento de separação da membrana16.

Após a lyse, as membranas totais são coletadas por ultracentrifugação e aplicadas a um gradiente de densidade de sacarose descontínua para fracionar os IMs e OMs. A abordagem clássica utiliza um gradiente mais contínuo que consiste em pelo menos cinco soluções diferentes de sacarose11,12. O gradiente descontínuo em nosso protocolo consiste em três soluções de sacarose e divide as bicamadas em duas frações distintas17. As moléculas de LOS e LPS dentro dos OMs de bactérias Gram-negativas levam o envelope à partição em uma fração de IM de baixa densidade marrom superior e uma fração OM branca inferior de alta densidade(Figura 1 e Figura 2).

Acinetobacter baumannii são importantes patógenos humanos multidroga resistentes que produzem moléculas de LOS em seu OM e erguem um envelope celular difícil de separar18,19. Trabalhos recentes sugerem que uma derivação do protocolo que apresentamos aqui pode ser usada para particionar as bicamadas desses organismos20. Portanto, testamos nosso protocolo em A. baumannii 17978. Inicialmente, o procedimento foi inadequado. No entanto, modificamos a concentração de sacarose da solução de densidade média e melhoramos muito a separação(Figura 2). Um ensaio de nadh desidrogenase e um procedimento de extração e detecção de LOS/LPS foram utilizados para confirmar a separação para A. baumannii, tipo selvagem S. Tipilásurio e dois genótipos enterobacterianos deficientes de oantígeno; ou seja, gale-mutante S. Typhimurium e uma cepa de laboratório, E. coli DH5α (Figura 3 e Figura 4).

A intenção deste trabalho é fornecer uma abordagem simplificada para isolar reprodutivelmente as membranas das bactérias Gram-negativas. O protocolo pode ser usado para estudar muitos tipos de moléculas associadas à membrana para esses micróbios.

Protocol

1. Reagentes gerais e preparação de mídia para extração de membrana Mídia de crescimento bacteriano: Prepare e esterilize 1 L de caldo em um frasco de 2 L completamente limpo e autoclavdo. Tampão de resuspensão geral (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): Dissolver 6,05 g de base tris em 30 mL de H2O. Ajuste pH para 7.5 com 5 M HCl. Ajuste o volume final para 50 mL com Ultrapure H2O. Estoque mestre da solução de quelação divalente (0,5 M EDTA pH 8; 100 mL): Adicio…

Representative Results

Esta técnica fornece um meio eficaz para isolar os IMs e OMs para bactérias Gram-negativas. Ilustra-se um esboço de todo o procedimento (Figura 1). Em geral, a normalização das culturas para um OD600 de 0,6-0,8 em 1 L de mídia, ou a colheita entre 6,0 e 8,0 x 1011 células bacterianas garantirá que a quantidade apropriada de material de membrana seja coletada para posterior separação. Ao averiar as bactérias e ultracentrifugiar o ly…

Discussion

Esse método continuará auxiliando os pesquisadores na compreensão do papel do envelope celular na fisiologia bacteriana e na patogênese. Seguindo os passos sequenciais de ultracentrifugação, pode-se obter uma fração total purificada, interna e OM. Essas membranas podem ser submetidas isoladamente para testar hipóteses relacionadas à localização e função da proteína da membrana, transporte e tráfico através do periplasma e à composição dos bicamadas individuais sob várias condições ambientais. Estud…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por P20GM10344 e R01AI139248 concedido a Z. D. Dalebroux.

Materials

1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF – TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 – IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma – Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

References

  1. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
  2. Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
  3. Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
  4. Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
  5. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  6. Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
  7. Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
  8. Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
  9. Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).
  10. Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
  11. Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
  12. Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
  13. Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. , (2019).
  14. Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
  15. Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
  16. Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
  17. Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
  18. Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
  19. Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
  20. Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).

Play Video

Cite This Article
Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).

View Video